[發明專利]一種HLA-G全長蛋白及其表達載體、表達工程菌和制備方法

有效

• 申請號: 202011129616.0
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112239766B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 袁文文;易汪雪;于倩;王營;柯紅;殷婷子
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/12;C12N1/21;C07K14/74;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 江慧

本發明提供了一種HLA?G全長蛋白及其表達載體、表達工程菌和制備方法，所述表達載體的表達區的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述工程菌包含所述的HLA?G全長蛋白表達載體。所述HLA?G全長蛋白由所述的HLA?G全長蛋白表達工程菌經誘導表達和純化制備得到。本發明采用優化的大腸桿菌表達系統，體外表達人HLA?G全長蛋白，實現了人HLA?G全長蛋白的高產量、高純度表達；本發明提供人HLA?G全長蛋白，包含跨膜區，且經過ELISA驗證具有與天然蛋白相似的結構，該方法可以制備出高產量、高純度、具有結構活性的人HLA?G全長蛋白。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種HLA-G全長蛋白及其表達載體、表達工程菌和制備方法。

背景技術

HLA-G是由Geraghty于1987年首次克隆出來的位于6號染色體短臂的一類免疫耐受分子，屬于人類一種非經典的主要組織相容性復合體(major histocompatibilitycomplex， MHC)的I類分子，選擇性高表達于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養細胞。妊娠被認為是成功的同種異體移植，很多妊娠相關疾病與滋養細胞異常增殖、浸潤、胎盤形成不良有關。HLA- G基因與經典的HLA I類基因具有高度同源性，均含有8個外顯子、7個內含子和3'非翻譯區(3'UTR)。HLA-G初始轉錄產物經選擇性剪切產生7種mRNA異構體，分別編碼4種膜結合型HLA-G分子(HLA-G1-HLA-G4)和3種可溶型HLA-G分子(HLA-G5-HLA-G7)。到目前為止，臨床上檢測到的HLA-G主要是HLA-G1和HLA-G5分子。HLA-G由含α1、α2和α3結構域的重鏈以非共價鍵結合15號染色體編碼的輕鏈蛋白B2M及抗原肽，組成抗原肽復合物結構。其作用是將內源性加工處理的抗原肽呈遞給T細胞供其識別。在缺少B2M的情況下，HLA-G也可以不結合B2M，而以游離的重鏈或以二硫鍵連接兩條重鏈形成同源二聚體的形式存在于細胞表面。早期發現HLA-G由羊膜細胞、紅系前體細胞、細胞滋養層等分泌，其主要作用是抑制NK細胞的功能，避免NK細胞攻擊具有抗原性的同種異體的胎兒。研究發現妊娠失敗率的升高與胎盤HLA-G的表達減少有關。在健康人群體中發現HILA-G蛋白質僅在角膜、胰島細胞、胸腺等組織器官中表達。有人認為 HLA-G可能與血管生成和(或)胎盤形成有關，普遍接受的觀點認為HLA-G是一種免疫耐受分子，可以直接結合各種抑制性受體對免疫系統起到免疫抑制作用，也可以使T細胞分化為抑制性T細胞，從而發揮免疫抑制作用。后續研究陸續發現，HLA-G在病理狀態如習慣性流產，先兆子癇，感染性疾病，腫瘤，移植排斥和其他免疫相關性疾病等情況時也能被誘導異常表達。目前普遍認為，HLA-G抗原可誘導胎兒逃避母體的免疫識別，由于它主要在母胎界面表達，其限制性表達、多態性及穩定性能阻斷宮內NK細胞的殺傷功能，因此能保護胎兒滋養層細胞免受NK細胞殺傷。如果滋養層細胞HLA-G表達下降，就會激活NK細胞介導的溶胞作用，造成母體對胚胎抗原的免疫攻擊而導致流產。先兆子癇(pre-eclampsia，PE)患者HLA-G基因第8外顯子的插入/缺失多態性分布顯著性偏離Hardy-Weinberg平衡，表現為雜合度過高，且在多數PE患者的胎盤中HLA-G缺乏或表達水平降低，說明HLA-G的表達對PE也有一定的影響。據認為在抗感染方面對各種炎性紊亂性疾病如多發性硬化癥、顱內出血、腸胃炎、皮膚病、風濕性疾病、哮喘等HLA-G具有免疫調節作用。在如CMV，HSV-1、HIV-1、狂犬病毒、HCV、甲流感病毒等病毒感染中， HLA-G具有逃逸免疫監視的作用。HLA-G表達于實體腫瘤，如黑素瘤、肉瘤和淋巴瘤等。在原發性黑素瘤細胞和轉移細胞表面高表達各種HLA-G異構體。這些HLA-G分子使腫瘤細胞能逃避NK細胞和CTL細胞的殺傷，溶解作用，這是一種新的腫瘤細胞逃脫免疫監視的機制。非實體腫瘤，絨毛膜癌的發生也可能與HLA-G分子抑制NK細胞的殺傷作用有關。HLA-G可能通過抑制NK細胞和(或)CTL細胞激活而下調移植排斥反應。HLA-G 分子的參與有助于在供受者HLA不相配時提高移植受者生存率，并可能抑制異種移植排斥。HLA-G是一種免疫耐受分子，其在習慣性流產、先兆子癇、感染性疾病、腫瘤、移植排斥和其他免疫相關性疾病發生中的作用及應用受到了廣泛關注。同時，HLA-G具有抗原呈遞功能，可與NK、T、B細胞等免疫細胞上的抑制性受體ILT2/ILT4/KIR2DL4結合，參與調控免疫炎癥反應，抑制NK、T、B細胞的增殖；在母親血液、卵泡液、生殖道，胎盤的胚胎及滋養層細胞及父親精液中的綜合表達在妊娠免疫調節中發揮著重要作用。說明 HLA-G是一個很有前景的研發靶點，有非常大的潛在價值。然而因HLA-G是跨膜蛋白，其全長蛋白難以體外表達純化。