[發(fā)明專利]一種SARS-CoV-2假病毒小鼠體內(nèi)包裝系統(tǒng)及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011106870.9
• 申請(qǐng)日: 2020-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN111926041B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝鵬;胡策;葉釗成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州吉妮歐生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C07K14/165;A01K67/027
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種假病毒小鼠體內(nèi)包裝系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1構(gòu)建SARS-CoV-2假病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)：首先構(gòu)建含有SARS-CoV-2 S蛋白的包膜蛋白質(zhì)粒，再構(gòu)建包裝質(zhì)粒，最后構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，獲得SARS-CoV-2假病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)；

其中所述構(gòu)建含有SARS-CoV-2 S蛋白的包膜蛋白質(zhì)粒的方法為：首先，以pMD2.G載體為骨架，用酶切的方式將其VSV-G序列切除，用SARS-CoV-2 S蛋白的CDS區(qū)替換所述切除序列，獲得替換后的包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S) ，其質(zhì)粒圖譜如圖2所示；然后，以PCR擴(kuò)增方式從質(zhì)粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S)上獲取從CMV enhancer到SARS-CoV-2-S的序列片段，用gateway的方式將該段序列插入到骨架質(zhì)粒PH-TB的兩個(gè)ITR(L)和ITR(R)序列之間，獲得包膜蛋白質(zhì)粒PH-TB-SARS-CoV-2-S，其質(zhì)粒圖譜如圖3所示；

所述構(gòu)建包裝質(zhì)粒的方法為：以PCR擴(kuò)增方式從質(zhì)粒psPAX2上獲取從CMV enhancer到GAG-POL的序列片段，用gateway的方式將該段序列插入到骨架質(zhì)粒PH-TB的兩個(gè)ITR(L)和ITR(R)序列之間，獲得包裝質(zhì)粒PH-TB-GAG-POL，其質(zhì)粒圖譜如圖4所示；

所述構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的方法為：首先，以gateway的方式將luciferase序列插入到骨架質(zhì)粒pCDH-CMV中的CMV promoter序列之后，獲得中間質(zhì)粒pCDH-CMV-LUC，其質(zhì)粒圖譜如圖5所示；其次，以PCR擴(kuò)增方式從中間質(zhì)粒pCDH-CMV-LUC上獲取從5’LTR到3’ LTR的序列片段，用gateway的方式將該段序列插入到骨架質(zhì)粒PH-TB的ITR(L)和ITR(R) 序列之間，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PH-TB-LUC，所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒圖譜如圖6所示；

S2將SARS-CoV-2假病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)與睡美人轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)?；旌贤ㄟ^水動(dòng)力注射的方式轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞，然后睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將所述質(zhì)粒PH-TB-LUC、質(zhì)粒PH-TB-GAG-POL和質(zhì)粒PH-TB-SARS-Cov-2-S中ITR(L)和ITR(R)之間的序列片段以剪切粘貼的方式插入到小鼠基因組中；

所述步驟S2具體步驟為：將睡美人轉(zhuǎn)座子表達(dá)質(zhì)粒與步驟S1構(gòu)建的假病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)按比例混合后，從尾靜脈采用水動(dòng)力注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，獲得在小鼠體內(nèi)持續(xù)生產(chǎn)的SARS-CoV-2假病毒；

其中，所述小鼠為能表達(dá)人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2的小鼠。

2.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法在模擬SARS-CoV-2病毒對(duì)動(dòng)物靶器官的持續(xù)侵入方面的應(yīng)用。

3.一種SARS-CoV-2 S假病毒小鼠體內(nèi)包裝系統(tǒng)，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的制備方法制備而成。

4.如權(quán)利要求3所述的SARS-CoV-2 S假病毒小鼠體內(nèi)包裝系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)生產(chǎn)SARS-CoV-2假病毒方面的應(yīng)用。

5.一種持續(xù)生產(chǎn)SARS-CoV-2假病毒的動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于，采用以下步驟實(shí)現(xiàn)：

S1采用權(quán)利要求1的制備方法制備假病毒小鼠體內(nèi)包裝系統(tǒng)中的包膜蛋白質(zhì)粒PH-TB-SARS-CoV-2-S、包裝質(zhì)粒PH-TB-GAG-POL和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PH-TB-LUC；

S2將步驟S1的包裝系統(tǒng)與睡美人轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)?；旌虾螅捎盟畡?dòng)力方式從尾靜脈注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)；

S3 所述步驟S2中的混合質(zhì)粒經(jīng)靜脈血流通過內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙進(jìn)入肝細(xì)胞，并在肝細(xì)胞中形成內(nèi)吞小泡，由此轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，將SARS-CoV-2假病毒包裝系統(tǒng)的目的序列整合到肝細(xì)胞的基因組中，獲得能續(xù)生產(chǎn)SARS-CoV-2假病毒的動(dòng)物；所述動(dòng)物為小鼠；所述小鼠為能表達(dá)人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2的小鼠。