[發明專利]牛誘導擴展多能性成體干細胞、建系方法及培養液

在審

• 申請號: 202011105359.7
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN114369577A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 李喜和;趙麗霞;王子馨
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學;內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/074
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，包括以下步驟:

(a)解凍牛成纖維細胞，在牛成纖維細胞培養液上培養，待細胞匯合度達到80％以上，收集細胞計數1×10⁶；

(b)轉入外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG，在提前解凍的飼養層細胞上培養，培養條件為M15+DOX培養液；

(c)待干細胞克隆長出后，挑入細胞因子培養液培養，隔天換液，1到5天構建成牛誘導擴展多能性成體干細胞系。

2.根據權利要求1所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述外源基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、LIN28、Nanog、LRH1和RARG的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1-8所示。

3.根據權利要求1所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于：所述牛成纖維細胞培養液是在DMEM培養基中，添加10％FBS，1×谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，1×青鏈霉素。

4.根據權利要求1所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述M15+DOX培養液是在DMEM培養基中，添加15％FBS、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青鏈霉素及強力霉素Dox。

5.根據權利要求1所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述細胞因子培養液包括：(1)有效量的成纖維細胞生長因子或其等效物；(2)有效量的一種或多種Wnt信號通路抑制劑；(3)有效量的一種或多種GSK-3α/β信號通路抑制劑；(4)有效量的一種或多種Lck/Src信號通路抑制劑；(5)有效量的Activin A蛋白或其等效物。

6.根據權利要求5所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述Wnt信號通路抑制劑為IWR-1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654、SKL2001、KY02111、IWP-2、IWP-L6、FH535、WIKI4、PRI-724、IQ-l、KYA1797K、C59、ETC-159、G007-LK、G244-LM中的一種或多種。

7.根據權利要求5所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述GSK-3α/β信號通路抑制劑為CHIR99021、B216763、AT7519、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、6-溴靛玉紅-3'-丙酮肟(BIO-acetoxime)、IM-12、1-氮雜坎帕羅酮(1-Azakenpaullone)、靛玉紅(Indirubin)、Bikinin中的一種或多種。

8.根據權利要求5所述的牛誘導擴展多能性成體干細胞的建系方法，其特征在于，所述Lck/Src信號通路抑制劑為WH-4-023、達沙替尼(Dasatinib)、塞卡替尼(Saracatinib)、普納替尼(Ponatinib)、SKI-606、KX2-391(Tirbanibulin)、NVP-BHG712、PP2、PP121中的一種或多種。