[發明專利]一種產L-氨基酸的重組菌株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202011105063.5
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112266891A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 魏愛英;孟剛;周曉群;趙春光;馬風勇;賈慧萍;楊立鵬;蘇厚波
• 申請（專利權）人: 內蒙古伊品生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C07K14/34;C12N15/77;C12P13/08;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 田芳

本發明提供一種對棒桿菌中NCgl0609基因編碼序列引入點突變或改進其表達的方法，所述方法可以使帶有所述突變的菌株提高氨基酸的發酵產量。所述點突變是使NCgl0609基因序列第1000位堿基由胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(T)，使編碼的相應氨基酸第334位精氨酸被終止子所取代。

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物技術領域，具體涉及一種產L-氨基酸的重組菌株及其構建方法與應用。

背景技術

L-賴氨酸(L-Lysine)應用范圍廣泛，包括醫藥、食品、飼料等各方面，其中被應用于飼料添加劑的L-賴氨酸占總量的90％以上。當前，我國是L-賴氨酸第二大消費市場，第一大L-賴氨酸生產國。

目前L-賴氨酸主要采用直接發酵法生產，直接發酵法利用具備完整L-賴氨酸生物合成途徑的菌株，以廢糖蜜、淀粉水解液等為底物，通過好氧發酵生產。該方法占當今世界L-賴氨酸生產的2/3，工藝已十分成熟，該方法主要存在于酵母、細菌、霉菌之中，在微生物中廣泛存在。目前，工業上用于L-賴氨酸發酵的生產菌種主要是棒狀桿菌和短桿菌屬的誘變育種突變株。隨著代謝工程和基因工程的發展，使得基因突變可控，因此在利用代謝工程改造出發菌株的過程中，能夠精確找到代謝過程中L-賴氨酸生產的關鍵酶基因，然后提高關鍵酶基因的表達，L-賴氨酸產量的提高才有可能實現。

L-谷氨酸主要用于生產味精、香料，以及用作代鹽劑、營養增補劑和生化試劑等。L-谷氨酸本身可用作藥物,參與腦內蛋白質和糖的代謝,促進氧化過程,該品在體內與氨結合成無毒的谷酰胺,使血氨下降,減輕肝昏迷癥狀。過去生產味精主要用小麥面筋(谷蛋白)水解法進行，現改用微生物發酵法來進行大規模生產。

發明內容

本發明的目的是開發具有L-氨基酸生產能力的新菌株，從而提供一種有效生產L-氨基酸的方法。

為了實現上述目的，本發明的發明人通過研究發現，現有技術未知具有發酵氨基酸生產能力的NCgl0609基因通過修飾該基因或改善其表達，能夠具備高效的L-氨基酸生產能力?；谶@些發現，完成了本發明。

本發明提供了生成L-氨基酸的細菌，其中編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表達被改善。本發明還提供了通過使用所述微生物生產L-氨基酸的方法。

本發明的第一個方面提供了生成L-氨基酸的細菌，其中編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表達改善。根據本發明，所述表達改善是所述多核苷酸表達增強，或者編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有點突變，或者編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有點突變且表達是增強的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl0609編碼的蛋白。

所述細菌具有增強的L-氨基酸生產能力。

具有L-氨基酸生產能力的細菌可以是能夠在培養基中以優選0.5g/L以上，更優選1.0g/L以上的量積累目標L-氨基酸的細菌。

所述多核苷酸可以編碼與SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有約90％或更高、約92％或更高、約95％或更高、約97％或更高、約98％或更高、或約99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。

可以通過如下手段增強多核苷酸的表達：通過取代或突變表達調節序列、對多核苷酸序列引入突變、通過經由染色體插入或載體導入的多核苷酸拷貝數的增加、或其組合等。

可以修飾多核苷酸的表達調節序列。表達調節序列控制與其可操作連接的多核苷酸的表達，并且例如可以包括啟動子、終止子、增強子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密碼子的變化。可以將多核苷酸摻入染色體的特定位點中，從而增加拷貝數。在本文，特定的位點可以包括例如轉座子位點或基因間位點。另外，可以將多核苷酸摻入表達載體中，將所述表達載體導入宿主細胞中，從而增加拷貝數。