[發明專利]一組靶向干擾IL-33表達的shRNA、重組腺病毒載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011101288.3
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112210556A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 張泉;賈苗苗;曹舒揚;朱立麒;殷俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/861;C12N15/66;A61K31/7088;A61P1/16
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了一組靶向干擾IL?33基因或蛋白表達的shRNA、重組腺病毒載體及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發明提供了一組靶向干擾IL?33基因或蛋白表達的shRNA，其對應的核苷酸序列如SEQ ID NOs：1～3所示。本發明還提供了一組分別包含3個shRNA序列的重組腺病毒載體。將三種重組腺病毒載體分別與穿梭質粒在脂質體和DMEM培養基條件下侵染真核細胞，包裝成3種能干擾IL?33基因表達的重組腺病毒。將三種重組腺病毒共同使用，能有效降低小鼠體內IL?33基因和蛋白的表達，為深入研究IL?33作為肝纖維化治療靶點的機制提供技術支持。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一組靶向干擾IL-33表達的shRNA、重組腺病毒載體及其構建方法和應用。

背景技術

RNA干擾技術是近十幾年一種新發展的基因工程技術，通過它可以高特異性地抑制靶基因表達，為研究某基因生物學功能以及個性化治療提供了一個寶貴工具。用腺病毒載體感染細胞可轉入目的基因，由于其高效和穩定的轉染特性，因此被廣泛用于基因沉默的研究。腺病毒家族成員眾多，但僅用于構建腺病毒載體的只有兩個，均屬于C亞屬，一個是2型腺病毒(Ad2)，另一個是5型腺病毒(Ad5)。腺病毒雙側末端均含ITR，含復制起始位點，便于其在細胞內正常復制。目前有四種腺病毒載體包裝系統：同源重組、Ad-Easy法、AdMax包裝系統和Ad5/F35MaxTm包裝系統。

白細胞介素33(Interleukine-33，IL-33)為白介素1類超家族成員細胞因子，最初發現在肝、胃、腎、肺中大量表達IL-33，而主要由內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞樣細胞和成肌纖維細胞產生，能促進Th2型細胞免疫調節作用。IL-33與ST2受體結合后將活化的信號傳遞至胞內，再通過髓樣分化因子88(MyD88)信號通路激活下游信號，進而釋放細胞內NF-κB復合物，造成細胞損傷。

自發現IL-33以來，其在治療慢性肝損傷中的作用已經取得了相當大的研究進展，其致病機制主要與IL-33激活肝星狀細胞，進而促進肝纖維化的能力有關。其生物學作用的多樣性和復雜性揭示其可通過不同機制參與疾病的發生和發展過程。IL-33已被認為是肝損傷發生前期的警報信號，因此可作為新的肝損傷標志物來預防肝臟疾病；此外，IL-33還可用于治療某些慢性肝損傷疾病，但過量使用亦可導致肝纖維化，產生副作用。而去除IL-33亦可減輕肝纖維化損傷，因此，IL-33似乎是治療肝纖維化一個新靶點，考慮到肝損傷來源，這些策略的實施有待進一步研究。

通過干擾IL-33基因的表達可以深入探究IL-33作為肝纖維化治療藥物的潛在可行性，而目前尚缺乏便捷、有效的干擾小鼠IL-33表達技術。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一組靶向干擾IL-33基因或蛋白表達的shRNA，能有效下調IL-33基因的表達量。

本發明的目的在于提供一組靶向干擾IL-33基因或蛋白表達的重組腺病毒載體及其構建方法，所述重組腺病毒載體包含靶向干擾IL-33基因或蛋白表達的shRNA，下調小鼠IL-33表達量。

本發明的目的還在于提供一組shRNA或重組腺病毒載體在制備治療肝纖維化損傷的藥物中的應用。

本發明提供了一組靶向干擾IL-33基因或蛋白表達的shRNA，包括shIL-33(250)、shIL-33(456)和shIL-33(594)；

所述shIL-33(250)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述shIL-33(456)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述shIL-33(594)的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本發明提供了一組靶向干擾IL-33基因或蛋白表達的重組腺病毒載體，包括所述shRNA。