[發(fā)明專(zhuān)利]超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011096422.5
• 申請(qǐng)日: 2020-10-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112266930B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋一之;郄興旺;馬玉婷;王策
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N13/00
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 祁云珊

1.一種超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)培養(yǎng)靶細(xì)胞；2)將靶細(xì)胞、目的對(duì)象和超聲造影劑混合于容器中；

3)使用超聲波作用于所述容器；

4)將所述容器在恒溫條件下再培養(yǎng)，以使目的對(duì)象充分進(jìn)入靶細(xì)胞；

所述步驟1)具體為：在6孔板中培養(yǎng)Hela細(xì)胞，于37℃下、5％二氧化碳?xì)夥罩信囵B(yǎng)3天，培養(yǎng)基為含2.5％牛血清的RPMI培養(yǎng)基；使用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入胰酶-EDTA消化細(xì)胞2min，再加入含2.5％牛血清的RPMI培養(yǎng)基；輕輕吹下細(xì)胞成單細(xì)胞懸液后，1200rpm室溫離心5min；

其中，目的對(duì)象為目的基因或目的蛋白，且當(dāng)目的對(duì)象為目的基因時(shí)，所述步驟3)具體為：將用于發(fā)出超聲波的換能器置于玻璃管底部，且換能器與玻璃管底部之間的距離保持在10-30mm，調(diào)整超聲波的頻率為800-900kHz，使換能器發(fā)出的超聲波作用于玻璃管30-120s；

所述步驟4具體為：將玻璃管置于恒溫培養(yǎng)箱中12min，以使目的基因充分進(jìn)入靶細(xì)胞；將玻璃管從恒溫培養(yǎng)箱中取出，將玻璃管中的細(xì)胞懸浮液接種于預(yù)熱的含2.5％牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，上下吹打均勻后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，換新鮮的完全培養(yǎng)基，以去除上層的死細(xì)胞；培養(yǎng)24h后，完成轉(zhuǎn)染，在熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率；

其中，當(dāng)目的對(duì)象為目的蛋白時(shí)，所述步驟3)具體為：將用于發(fā)出超聲波的換能器置于玻璃管底部，且換能器與玻璃管底部之間的距離保持在10-30mm，調(diào)整超聲波的頻率為800-1200kHz,使換能器發(fā)出的超聲波作用于玻璃管30-120s；

所述步驟4具體為：將玻璃管置于恒溫培養(yǎng)箱中3h，以使目的蛋白充分進(jìn)入靶細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)染；將玻璃管從恒溫培養(yǎng)箱中取出，用PBS緩沖溶液洗滌后在熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其特征在于，其中，目的基因?yàn)閹в芯G色熒光的pEGFP-C1質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟2)具體為：將超聲造影劑配置在5ml PBS緩沖液中，再加入靶細(xì)胞、目的基因，其中，目的基因的最終濃度為20ug/ml，超聲造影劑的最終濃度為1×10⁶/ml-1×10⁷/ml；然后將得到的混合體系轉(zhuǎn)移至玻璃管中。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其特征在于，其中，目的蛋白為帶熒光標(biāo)記的牛血清蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超聲穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟2)具體為：將1ug帶熒光標(biāo)記的牛血清蛋白重懸于10ul超聲造影劑中，得到混合液，然后取2.5ul該混合液與200ul靶細(xì)胞混合于玻璃管中。