[發(fā)明專利]一種含三突變位點的油菜EPSPS基因及其克隆方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011093356.6
• 申請日: 2020-10-14
• 公開（公告）號: CN112094857B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳松;彭琦;孫程明;胡茂龍;付三雄;王曉東;張維;浦惠明;張潔夫
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/82;C12N15/62;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發(fā)明公開了一種含三突變位點的油菜EPSPS基因及其克隆方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過將油菜EPSPS基因第518處堿基由C變?yōu)門、第521處堿基由C變?yōu)門、第529處堿基由C變?yōu)門，創(chuàng)制了具有較強耐除草劑能力的油菜EPSPS基因(BnmEPSPS)，并且通過在所創(chuàng)制基因5’末端添加葉綠體信號肽序列并利用葉盤轉(zhuǎn)染使其成功在煙草中表達。本發(fā)明創(chuàng)制的油菜EPSPS基因具有高耐草甘膦除草劑的特性，極具有利用價值，有望在培育轉(zhuǎn)基因耐草甘膦除草劑農(nóng)作物中大量應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種含三突變位點的油菜EPSPS基因及其克隆方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

化學(xué)除草劑作為一種高效除草方法，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,Glyphosate)也稱農(nóng)達，屬于氨基甲膦酸類含羧基化合物，是一種非選擇性廣譜性除草劑。草甘膦目前已經(jīng)被100多個國家引進注冊，是全球使用面積最廣、產(chǎn)量最大的除草劑。

草甘膦作為一種內(nèi)吸型除草劑，既能殺死地上綠色部分，也能殺死地下根組織。其除草的機理已經(jīng)明確，草甘膦和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)分子結(jié)構(gòu)相似，同PEP競爭與EPSPS結(jié)合位點，阻礙EPSP生成。EPSPS是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶。EPSPS酶負責(zé)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)與烯醇式丙酮酸(PEP)結(jié)合，生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)，后者是芳香族氨基酸的重要合成前體。除草劑草甘膦對EPSPS酶活性的抑制，會導(dǎo)致植物體內(nèi)芳香族氨基酸缺乏、莽草酸積累，最終導(dǎo)致細胞死亡。

根據(jù)草甘膦的作用機理，理論上有3條基本途徑可以使植物獲得草甘膦抗性：1)植物內(nèi)源EPSPS合酶的過量表達；2)通過降解或修飾草甘膦來解除其抑制作用；3)植物表達外源的II型EPSPS合酶，即非敏感EPSPS合酶。實際應(yīng)用中，植物草甘磷抗性的獲得一般都基于第三條途徑，即非敏感EPSPS合酶的表達。

目前，抗草甘膦作物的抗性基因多來自微生物細菌，如農(nóng)桿菌CP4-EPSPS、I.variabilis-EPSPS等，而來源于植物突變的EPSPS基因鮮有報道，主要原因是缺乏高抗(耐)草甘膦的EPSPS基因。利用體外人工合成基因技術(shù)引入突變位點，創(chuàng)造植物來源的耐草甘膦的EPSPS基因，再通過遺傳工程培育轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物，是一條值得探索的途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種含三突變位點的油菜EPSPS基因及其克隆方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，并利用所述基因作為培育抗草甘膦植物的手段。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

本發(fā)明提供一種含三突變位點的油菜BnmEPSPS基因，所述的三突變位點為第518處堿基由C變?yōu)門、第521處堿基由C變?yōu)門、第529處堿基由C變?yōu)門三突變位點，突變后的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供所述的含三突變位點的油菜BnmEPSPS基因所編碼的蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還提供含有所述的含三突變位點的油菜BnmEPSPS基因的轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，在所述含三突變位點的轉(zhuǎn)基因植物的5’末端添加一葉綠體信號肽序列，之后克隆到載體上再轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物中。

優(yōu)選的，所述葉綠體信號肽序列如SEQ ID NO.5所示。

優(yōu)選的，所述的載體為pCAMBIA1304。

優(yōu)選的，利用重組法將所述基因克隆到載體中。

優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物中的步驟包括葉盤外植體轉(zhuǎn)染、組織培養(yǎng)、盆栽移植。

優(yōu)選的，所述葉盤轉(zhuǎn)染方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。