[發明專利]一種對6個血清型霍亂弧菌的實時熒光PCR檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202011082558.0
• 申請日: 2020-10-12
• 公開（公告）號: CN112592987A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 劉斌;穆會乾;王婧;郭璽
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明涉及對霍亂弧菌O14、O22、O34、O37、O59、O140血清型使用基于MGB探針的實時熒光TaqMan聚合酶鏈式反應快速檢測體系進行分析。本發明以霍亂弧菌O抗原基因簇特異基因為靶基因，設計并篩選了用于霍亂弧菌的O抗原分型的引物及MGB探針，并建立了相應的實時熒光PCR（RT?PCR）檢測方法，為利用分子生物學手段對部分致病型霍亂弧菌的O抗原分型提供一條可信的途徑。利用本發明的RT?PCR檢測方法可對糞便、嘔吐物、河水、井水、海水、生鮮食品、各種材料用具標本中的6個血清型的霍亂弧菌進行準確檢測，具有高靈敏度、高特異性及快速檢測等諸多優點。

技術領域

本發明屬于細菌檢測方法技術領域，涉及用于霍亂弧菌6個O抗原血清型的實時熒光PCR檢測方法及應用。

背景技術

霍亂弧菌，革蘭氏陰性菌，包括兩個生物型:古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型(EL-Tor bio-type)，菌體彎曲呈弧狀或逗點狀，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞，在堿性平板上菌落直徑為2mm,圓形，光滑，透明。霍亂弧菌能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等產酸產氣，遲緩發酵乳糖；能分解色氨酸產生吲哚，同時能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。霍亂弧菌通過產生腸毒素引起烈性腸道傳染病霍亂，可分離于糞便、嘔吐物、河水、井水、海水、生鮮食品、各種材料用具標本中。隨著抗生素和免疫抑制劑的廣泛應用耐藥細菌呈現上升趨勢，但是在血清水平上，利用創傷抗血清進行鑒定受到變異、可用性和特異性的限制，所以需要一個更具體可行的分子分型方案。已知細菌表面多糖對不同的血清有特異性，如O抗原或莢膜，而根據O抗原的多樣性可以對霍亂弧菌的不同菌株進行分型鑒定。

TaqMan-MGB實時熒光PCR（Real-time fluorescence PCR）技術原理：將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值。

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，其 5' 末端攜帶熒光基團，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端攜帶淬滅基團，如TAMRA、BHQ等。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq 酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探針是近年來在 TaqMan探針的基礎上改進的一種新技術,它在探針3′端增加了MGB分子，這種物質能夠提高探針的退火溫度( Tm值) ，從而使它能夠分辨 1個堿基的差別，完全配對，有熒光信號；只要有一個堿基不匹配,就沒有信號。探針的設計首先為15-30 nt長度，Tm為68-70 ℃。在探針的 5' 末端，避免了可能引起熒光猝滅的G的存在。探針由AuGCT Biotechnology Corporation（中國北京）合成，分別在 5' 和 3' 末端具有6-羧基熒光素（FAM）和小溝結合（MGB）部分。引物的長度約為25 nt ，Tm在55-60 ℃之間。產生的PCR產物在50-200 bp之間。引物由Invitrogen（中國上海）合成。如果正向引物的3' 末端距離探針的5' 末端1-20 nt（通常為10 nt或更少），則可能更好。