[發明專利]一種基于原子力顯微術的腫瘤外泌體誘導細胞惡變過程的檢測方法

在審

• 申請號: 202011080743.6
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112285386A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 王作斌;鞠拓宇;王樹偉;王佳佳;陳玉娟;楊帆;姜曉琳;董莉彤;宋正勛;許紅梅;張景然
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: G01Q60/24
• 分類號: G01Q60/24
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種基于原子力顯微術的腫瘤來源外泌體誘導細胞惡變的檢測方法，屬于原子力顯微術成像技術領域。該外泌體通過超濾管離心的方法處理得到，將腫瘤來源外泌體與正常細胞共培養得到惡性細胞模型，檢測細胞的增殖和遷移能力，同時通過原子力顯微術對細胞進行多維信息檢測。本發明所提供的檢測方法，可在液態環境下對良性細胞轉化的惡性細胞模型進行實時成像、定量監測、可視化操作，獲得細胞的整體形態、彈性模量、粘附力、表面粗糙度和膜電位(力學特性和電學特性)變化，實現細胞惡性演變動態過程的多維信息檢測，為細胞異質性和細胞惡變新理論研究提供技術支持。

技術領域

本發明涉及原子力顯微術成像技術領域，具體涉及一種基于原子力顯微術的腫瘤來源外泌體誘導細胞惡變過程的檢測方法。

背景技術

外泌體是一種由細胞分泌到胞外形成的具有脂質雙層膜結構的微小囊泡，目前認為其直徑大小約為30-150nm。外泌體富含核酸、蛋白質和脂質，廣泛分布于血液、唾液和尿液等體液中，作為細胞間通訊的媒介，具有多種生物學功能。近年來，多項研究表明，外泌體的分泌和功能異常在惡性腫瘤的發生、發展和治療中起著至關重要的作用。

腫瘤細胞分泌的外泌體(稱為腫瘤來源外泌體)，研究表明，腫瘤來源外泌體通過細胞-細胞間通訊、血管生成和增殖途徑的激活，從而增強受體細胞的侵襲和遷移能力，最終誘導細胞發生惡變。

原子力顯微術作為納米尺度上細胞成像與操作的工具，不僅可以對活細胞表面超微形貌進行可視化表征，同時還可通過壓痕技術對細胞機械特性(如彈性模量、粘附力)進行定量測量。研究證實，細胞的力學特性可以作為細胞狀態監測的一個有效的物理標志。細胞骨架、細胞的粘附特性與細胞運動、分化和轉移等關聯密切。細胞的病理改變可以導致細胞力學性質的改變，例如細胞形變能力的改變，細胞粘連特性的改變，從而影響細胞生理特性的改變如蛋白表達異常，最后導致癌癥的發生和發展。研究發現，通過納米檢測細胞力學特性能夠對腫瘤細胞侵襲力進行評估，楊氏模量能定量描述腫瘤細胞侵襲力的改變。惡性程度高低不同的腫瘤細胞骨架分布不同，惡性程度低的細胞，細胞骨架排列相對有序，而惡性程度高的細胞，細胞內部骨架紊亂，細胞較柔軟，有利于細胞轉移。

然而，傳統生物學方法是從外泌體-細胞間的作用機理研究外泌體-細胞間的作用，忽視了外泌體對細胞物理特性的改變，無法直觀地對細胞進行多維信息檢測。而且尚未有報導通過腫瘤來源外泌體誘導良性細胞轉化形成惡性細胞模型的建立。本發明研究細胞惡變過程的多維信息檢測，突破傳統光學顯微技術在不加標記干預的條件下只能在亞微米水平上觀測活細胞，膜片鉗和MEA只能在微米尺度上測量電信號，光鑷和單探針原子力顯微鏡只能進行單一參數測量，其他方法只能測量死細胞的局限，以生物醫學、物理學、化學、信息學、原子力顯微術成像與操縱技術為基礎，在可控環境條件下對單細胞的形態、力學、電學多維信息進行檢測，在正常細胞與腫瘤來源外泌體共培養的環境下，研究細胞惡性演變的動態過程。

發明內容

本發明技術解決的問題：提供了一種基于原子力顯微術的腫瘤來源外泌體(或其他致癌物)誘導細胞惡變過程的檢測方法，通過對良性細胞轉化的惡性細胞模型進行多維信息檢測,研究細胞惡性演變的動態過程。

本發明的技術方案為：通過超濾管離心的方法獲取腫瘤來源外泌體，對所獲取的腫瘤來源外泌體進行驗證后，將腫瘤來源外泌體與正常細胞共培養，使用原子力顯微術在液態環境下對良性細胞轉化的惡性細胞模型進行多維可視化信息的檢測與表征。具體包括以下步驟：

(1)用接種液培養腫瘤細胞至鋪滿培養皿底，取腫瘤細胞上清液，通過高速離心機進行梯度離心，用0.22μm孔徑的濾器過濾梯度離心后的上清液，再將過濾后的上清液加入到超濾管中進行離心，最后加入磷酸鹽緩沖液再次離心得到腫瘤來源外泌體。

(2)利用掃描電鏡對步驟(1)獲取的腫瘤來源外泌體進行粒徑大小分析，通過蛋白免疫印記法對相關蛋白生物標志物CD9,CD63和CD81進行驗證。