[發明專利]一種豬圓環病毒3型的可視化LAMP檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202011070808.9
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN112176104A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 張杰;汪洋;丁耀忠;張維兵;李彥;馬炳;代軍飛;李茜;侯謙;李苗苗;孫躍峰;陳豪泰;劉永生;張永光
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王芊雨

1.一種檢測豬圓環病毒3型的LAMP引物組，其特征在于：所述引物組為以下六條引物：

PCV3-F3：5'-ACGGTGGGGTCATATGTGTTG-3'，

PCV3-B3：5'-CTGGACCACAAACACTTGGCT-3'，

PCV3-FIP：5'-ATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCATGGGGTGGGTCTGGAG-3'，

PCV3-BIP：5'-GGGGTGAAGTAACGGCTGTGTTTAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGAC-3'，

PCV3-FLOOP：5'-CACCCAGGACAAAGCCTCTT-3'，

PCV3-BLOOP：5'-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3'。

2.一種檢測豬圓環病毒3型的LAMP試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒主要由豬圓環病毒3型可視化LAMP檢測試劑盒組成；

所述豬圓環病毒3型可視化LAMP檢測試劑盒其成分如下：1080μl PCV3恒溫擴增反應液、60μl Bst DNA聚合酶、30μl LAMP PCV3陽性對照、30μl LAMP PCV3陰性對照、1200μl礦物油；

所述恒溫擴增反應液中主要包括擴增豬圓環病毒3型Cap蛋白編碼基因的LAMP引物、擴增緩沖液和中性紅顯色染料；其中擴增豬圓環病毒3型Cap蛋白編碼基因的LAMP引物預混液的終濃度分別為：

0.08μM PCV3-F3/PCV3-B3、0.8μM PCV3-FIP/PCV3-BIP、0.2μM PCV3-FLOOP/PCV3-BLOOP。

4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的檢測反應條件為：64℃，60分鐘；終止反應。

5.權利要求2所述的試劑盒的使用方法，其特征在于：所述試劑盒的使用方法為：

1)常規樣品核酸提取：

任何方法制備得到的DNA都可以作為豬圓環病毒3型可視化LAMP檢測試劑盒的待檢測模板；

2)豬圓環病毒3型可視化LAMP檢測：

向對應的反應管中加入制備好的樣品DNA模板1μl，然后向陰性對照管內加入1μl LAMP陰性對照，最后向陽性對照管內加入1μl LAMP陽性對照；

反應體系：

3)免核酸提取的豬圓環病毒3型可視化LAMP檢測

采集的豬血清或者豬全血上清液，可以直接擴增，不需要核酸提取。

向對應的反應管中加入豬血清或者豬全血上清液1μl，然后向陰性對照管內加入1μlLAMP陰性對照，最后向陽性對照管內加入1μl LAMP陽性對照；

反應體系：

4)將分別加入待檢核酸樣品或者豬血清樣品或者豬全血樣品、LAMP陰性對照與LAMP陽性對照的反應管加熱；

所述加熱反應管采用水浴鍋、金屬浴或者常規PCR儀中的一種；

所述水浴鍋或沒有熱蓋的金屬浴則需向每管表面加入20μl礦物油，采用帶熱蓋的金屬浴或者常規PCR儀則無需加入礦物油；

5)預熱好相應的儀器，64℃反應60分鐘，反應結束后及時取出反應管，或者保持在室溫或者4℃，反應結束后即可直接肉眼觀察判定結果；

6)結果判定：

a)陰性對照樣品管反應結束后顏色為橘黃或者橘色，陽性對照樣品管變為粉紅色，若二者均成立才可判定試驗成立，否則試驗無效；

b)試驗成立時，若待檢樣品管顏色變為和陽性對照樣品管顏色一致或接近的粉紅色則判為陽性。