[發明專利]一種基于構建ATP再生系統高效催化合成PAPS的方法

有效

• 申請號: 202011069179.8
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN113046403B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 康振;堵國成;王陽;胥睿睿;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種基于構建ATP再生系統高效催化合成PAPS的方法，屬于生物工程技術領域。通過微生物重組表達人工構建PAPS合成雙功能酶，實現了PAPS的高效率生產。在此基礎上，耦聯了谷氨酸棒桿菌和結核分枝桿菌來源的聚磷酸激酶的ATP再生系統，可同時回收兩種副產物焦磷酸和ADP，實現底物與產物的等量轉化，催化體系中生成的PAPS具有較高的純度，能實現大部分磺酸轉移反應中磺酸基團的供給。

技術領域

本發明涉及一種基于構建ATP再生系統高效催化合成PAPS的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate，PAPS)是體外磺酸反應最重要的活性磺酸供體，可用于硫酸軟骨素、肝素和硫酸皮膚素的磺酸化基團供給。

目前PAPS購買渠道狹窄，價格昂貴且純度不高，主要原因為體外酶法合成PAPS轉化率低，副產物難以去除，PAPS純化困難。

在PAPS酶法合成中，主要產生兩種副產物焦磷酸和ADP，使得底物的理論轉化率僅為50％。副產物的重新利用是PAPS高效生產的重要研究內容，在目前的研究中多從聚磷酸激酶的角度入手，以期將副產物轉化再利用，但是大多數的聚磷酸激酶只能轉化ADP，而并不能轉化焦磷酸，仍然存在著副產物不能得到充分利用的問題。

發明內容

[技術問題]

在酶法合成PAPS的過程中，由于副產物焦磷酸和ADP的產生，大量物質流和能量流被浪費，導致PAPS合成價格高昂且難于得到純度較高的PAPS。已有報道的聚磷酸激酶大部分都只能轉化ADP，而不能轉化焦磷酸，但是在酶法制備PAPS中，副產物焦磷酸的量也比較大，如果只能轉化ADP的話，那么剩余的焦磷酸還是不能被充分利用，造成了資源的浪費。

[技術方案]

發明人從少數能夠同時轉化ADP和焦磷酸的聚磷酸激酶中選出了一種酶活力高且能高效利用ADP和焦磷酸的聚磷酸激酶。基于篩選出的聚磷酸激酶，將其與酶法催化生成PAPS的系統進行耦聯，可同時回收副產物焦磷酸和ADP合成底物ATP，繼續參加PAPS的合成，實現無副產物的PAPS的合成，在催化體系中有極高的PAPS純度，應用廣泛。從而提高了整個反應過程的轉化率、顯著降低了生產成本、提升了效率。

本發明提供了一種合成PAPS的方法，在酶法轉化合成PAPS的反應中加入聚磷酸激酶；所述酶法轉化合成PAPS是以ATP為底物，以能將ATP轉化為PAPS的酶為催化劑。

在本發明的一種實施方式中，所述聚磷酸激酶包括但不限于來源于谷氨酸棒桿菌、結核分枝桿菌、銅綠芽孢桿菌或鏈霉菌。

在本發明的一種實施方式中，來源于結核分枝桿菌的聚磷酸激酶的Gene?ID為888760。

在本發明的一種實施方式中，所述聚磷酸激酶來源于谷氨酸棒桿菌，Gene?ID為1020661。

在本發明的一種實施方式中，所述能將ATP轉化為PAPS的酶為APS激酶和ATP硫酸化酶；或是通過linker將APS激酶和ATP硫酸化酶連接得到的PAPS合成雙功能酶。

在本發明的一種實施方式中，所述APS激酶的Gen?Bank號為M74586.1。

在本發明的一種實施方式中，所述ATP硫酸化酶的Gene?ID為853466。

在本發明的一種實施方式中，所述linker的序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，反應體系中還含有硫酸鹽作為硫酸根供體，硫酸鹽包括但不限于硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸鉀。

在本發明的一種實施方式中，硫酸鹽可優選為硫酸鎂。