[發明專利]一種柑橘黃龍病快速檢測方法

在審

• 申請號: 202011065602.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112195223A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 趙春江;董宏圖;張晗;王曉冬;羅斌;王成;侯佩臣;李愛學
• 申請（專利權）人: 北京農業智能裝備技術研究中心;北京農業信息技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明實施例提供一種柑橘黃龍病快速檢測方法，包括：提供從待測植物中獲得的柑橘黃龍病病菌DNA；其中，所述柑橘黃龍病病菌DNA的濃度為20ng/μl；以所述柑橘黃龍病病菌DNA為模板進行3次PCR擴增，擴增循環數分別為20?25次、25?30次和30?40次；對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統得到擴增結果；根據擴增結果獲得待測植物柑橘黃龍病的發病程度。本發明方法可為黃龍病等植物病害的檢測分級提供定性的判別依據，同時可針對不同感病程度進行有針對性的防治提供準確的評測手段。

技術領域

本發明涉及一種柑橘黃龍病快速檢測方法。

背景技術

黃龍病是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生產上危害最嚴重，強破壞性的毀滅性病害。黃龍病被認為是由一種專生于柑橘韌皮部組織的細菌引起的，其傳播途徑包括苗木嫁接以及柑橘木虱傳播。

目前所有已知的柑橘品種及柑橘近緣種都受到黃龍病病菌的侵染。感染病后的植株不僅不能產生經濟價值，且易感程度高的品種如臍橙、葡萄柚等會在幾年內逐漸衰亡，且目前尚無黃龍病治療康復的相關報道。因此提供一種快速的黃龍病病菌鑒定分級方法，對于黃龍病的防控和研究具有重要的意義。

目前針對黃龍病病菌的診斷方法主要包括田間診斷、血清學方法診斷、電鏡檢測診斷和PCR檢測診斷等手段。受到柑橘寄主植株內黃龍病病原菌濃度低、分布不均勻及樣品制備技術等因素的限制，柑橘黃龍病原菌抗體多數均只能與相似的抗原結合，不能廣泛應用于不同區域、品種的檢測；電鏡觀察檢測的檢出率一般在70％左右，存在大量的漏檢；目前常規PCR診斷方法在柑橘黃龍病檢測上的應用已經實現了快速、準確、定性的要求，被廣泛用于黃龍病的實驗室診斷。但PCR只能對柑橘屬果樹是否感染黃龍病病菌進行檢測，但無法有效區分感病植株的感病程度。由此提供一種簡單、快捷、準確的柑橘黃龍病快速鑒定分級方法對于柑橘黃龍病田間防治、病樹早期干預治療具有重要意義。

發明內容

本發明實施例提供一種柑橘黃龍病快速檢測方法，可為黃龍病等植物病害的檢測分級提供定性的判別依據，同時可針對不同感病程度進行有針對性的防治提供準確的評測手段。

一種柑橘黃龍病快速檢測方法，包括：

提供從待測植物中獲得的柑橘黃龍病病菌DNA；其中，所述柑橘黃龍病病菌DNA的濃度為20ng/μl；

以所述柑橘黃龍病病菌DNA為模板進行3次PCR擴增，擴增循環數分別為20-25次、25-30次和30-40次；

對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統得到擴增結果；

根據擴增結果獲得待測植物柑橘黃龍病的發病程度。

本文所述的柑橘黃龍病病菌是指韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter spp.)。

在一些實施例中，是從待測植物的葉片、莖(枝條)或根中獲得柑橘黃龍病病菌DNA。實際操作中可取適量的待測植物的葉片、莖或根，按常規方法提取其中的柑橘黃龍病病菌即可。

在一些實施例中，是從待測植物的葉片(例如0.1g)中提取獲得柑橘黃龍病病菌。

在一些實施例中，待測植物(例如柑橘)感病時間為1年-3年，例如1年、2年或3年。

在一些實施例中，采用StarSpin柱式植物DNA提取試劑盒，獲得土壤農桿菌DNA。

在一些實施例中，所用的特異性擴增引物為：