[發明專利]基于RPA和CRISPR技術的快速新冠病毒檢測儀

有效

• 申請號: 202011054817.9
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112410198B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 陳嘉芙;雷姚遠;沈小琬;黎雅詩;劉華鋒
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/70;C12Q1/6844;G08B5/36;G08B21/18;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 王琛

本發明公開了一種基于RPA和CRISPR技術的快速新冠病毒檢測儀，包括生物檢測模塊、光電探測模塊以及報警顯示模塊，系統將新冠病毒RNA樣本采集、核酸提取、擴增、熒光檢測四步合一，選用唾液作為檢測樣本使得采集更便捷，采用無需純化的RNA快速提取方法，利用RPA技術可在常溫進行縮短擴增時間，基于CRISPR的熒光檢測使得基因序列的檢測靈敏度提升，采用共聚焦光路、LED光源、光電倍增管，利用微弱光放大電路將微弱熒光信號放大并減弱噪聲，最后用LED亮燈進行檢測陽性的報警，取消顯示屏實時監測顯示，使得整個裝置結構簡單，對溫度要求低，成本低，靈敏度高，機器小便于攜帶，檢測時間短，僅需約1h。

技術領域

本發明屬于生物醫學光電檢測技術領域，具體涉及一種基于RPA和CRISPR 技術的快速新冠病毒檢測儀。

背景技術

RPA技術即重組酶聚合酶擴增，RPA主要分為4個步驟：第一步，重組蛋 白酶在輔助因子uvs Y的協助下與上下游引物形成酶-引物復合體；第二步，復 合物在模板上定位后直接啟動鏈交換反應，形成D狀環；第三步，重組酶uvs X 解離后引物的3′端暴露，被鏈置換DNA聚合酶識別進行鏈延伸，形成新的互補 鏈；第四步，在鏈置換DNA聚合酶系的協同作用下，開始特異性片段的擴增， 30min內就可以將靶序列擴增到10～12數量級，達到檢測水平；該反應最適溫 度在37～42℃，低成本、耗時短，整個過程在10～30min內即可完成，可實現核 酸的快速檢測。

與其他等溫方法相比，RPA對抑制劑具有更大的耐受性，可用于更復雜的 樣品，RPA引物探針設計較為簡單，其熒光檢測反應體系只需一對引物和一條 探針即可實現對目標基因的擴增并對整個擴增過程實時監控。此外RPA技術除 緩沖液及Mg2+外，其余體系組分均以干粉狀態保存于反應管中，穩定且易于保 存，在封閉的反應體系中也減少了污染的可能性，RPA技術被認為有望取代PCR 的核酸檢測技術。

CRISPR核酸檢測技術的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結合的向 導RNA。根據新冠病毒的RNA序列，研究人員設計了能夠靶向新冠病毒特異 性序列的向導RNA，它通過堿基對配對的方式，精準識別COVID-19中的RNA， 與此同時激活其上的Cas13a蛋白酶，Cas13a蛋白酶被激活后，會對周圍的單鏈 RNA進行瘋狂切割，當它切割可淬滅的熒光RNA，則以產生定量的熒光信號， 我們可以利用光電探測器探測試劑樣品中是否發出熒光，來確定是否存在新冠 病毒。

當前的新冠肺炎呈現出一系列的臨床癥狀，從輕度的流感癥狀到危及生命 的狀況，在感染者早期進行快速且有效的檢測以從其他疾病中識別出COVID-19 患者非常重要。遏制住疫情的重要方法是找到已感染人群、及時隔離，切斷感 染源，目前的常用檢測方法是核酸檢測，相較于溫度判斷的不準確性、CT檢測 的危害性、抗體免疫檢測的滯后性，核酸檢測更有效、安全、及時。

目前市場上的核酸檢測方法及其優缺點如下：

(1)實時熒光定量PCR檢測儀，現在市場上最常用的核酸檢測是逆轉錄酶 聚合酶鏈式反應RT-PCR檢測，需要經歷咽拭子采集、RNA提取、擴增、熒光 檢測四步，在咽拭子采集過程中對采集人員有嚴格的防護要求，RNA的提取和 擴增容易出現樣本污染，步驟復雜，需要溫度升高降低的反復循環，并且市場 上一臺實時熒光定量PCR檢測儀的價格超過了20萬元，非常昂貴，檢測的時間 在4～6小時，耗時長。

(2)雅培(Abbott)公司上市了一款運用等溫擴增技術的稱為ID NOW的快 速檢測平臺，陽性檢測只需5min，陰性檢測只需13min，但這并不包括咽拭子 的采集、RNA的提取步驟，且其檢測的準確性并沒有得到證實。

(3)來自加州大學舊金山分校及Mammoth Biosciences公司的研究人員開 發了一種基于CRISPR-Cas12分析技術的叫做SARS-CoV-2DETEDTR的檢測方 法，僅需30min的側向層析檢測，可直接通過試紙可視化判斷，更迅速直接， 但是咽拭子RNA的提取步驟仍需單獨進行。

發明內容