[發(fā)明專利]細(xì)粒棘球蚴免疫原性蛋白EG95組成型表達(dá)載體的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011050126.1
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112250748A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈萬忠;閆鴻斌;李立;郭愛民;李建秋;李文靜;李文卉;李樂;張林生;張念章;付寶權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 王芊雨

本發(fā)明提供一種細(xì)粒棘球蚴免疫原性蛋白EG95基因組成型表達(dá)載體，且提供含有該表達(dá)載體的畢赤酵母基因工程菌。申請人成功在畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)了EG95蛋白的分泌性表達(dá)，經(jīng)三角瓶搖床表達(dá)的蛋白濃度達(dá)到0.5g/L，目的蛋白純度達(dá)到90％以上。經(jīng)Westernblotting試驗證實，表達(dá)的重組蛋白與現(xiàn)有羊棘球蚴病EG95亞單位疫苗免疫陽性血清具有良好的反應(yīng)原性和特異性(與其他重組蛋白抗體無反應(yīng))。本發(fā)明從構(gòu)建的p?GAPZαA?Eg95重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168中篩選出可以高效穩(wěn)定地分泌表達(dá)EG95重組蛋白的工程菌，且不需使用誘導(dǎo)劑，顯著降低了生產(chǎn)周期、生產(chǎn)成本和生產(chǎn)的復(fù)雜性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)粒棘球蚴免疫原性蛋白EG95組成型表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

棘球蚴病(echinococcosis)，俗稱包蟲病，是由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲——棘球蚴寄生于動物(包括人)的肝、肺等組織而引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，是全球性重要公共衛(wèi)生問題之一。我國是包蟲病發(fā)病最高的國家之一。棘球蚴病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)歸為全球通報的傳染性疫病，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為17種被忽視的熱帶病(Neglected tropical diseases,NTDs)之一。棘球蚴病不僅影響著發(fā)展中國家和地區(qū)的貧困人群，而且對一些國家或地區(qū)動物及動物產(chǎn)品國際貿(mào)易構(gòu)成了障礙。

在棘球蚴病防治中，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于控制動物棘蚴病傳染源、切斷生活史循環(huán)鏈。一方面，需要對流行區(qū)牛、羊進(jìn)行免疫預(yù)防，同時，管控棘球蚴病變牛、羊內(nèi)臟未經(jīng)加工直接飼喂犬。另一方面，要按照“犬犬驅(qū)蟲、月月投藥”的方案對流行區(qū)的犬進(jìn)行驅(qū)蟲管理，從而實現(xiàn)對傳染源的控制。但是對終末宿主的驅(qū)蟲管理也存在一些弊端：驅(qū)蟲后糞便需要進(jìn)行無害化處理，如果處理不當(dāng)，易造成病原的進(jìn)一步擴(kuò)散；家養(yǎng)犬可以進(jìn)行定期驅(qū)蟲，但是對于流浪犬的驅(qū)蟲就很難管理，而對于狼、狐貍等野生動物終末宿主就更難進(jìn)行定期驅(qū)蟲，因此，通過免疫預(yù)防來控制和消滅包蟲病是有效而理想的途徑。

研究證實，棘球絳蟲六鉤蚴分泌抗原具有較好的保護(hù)作用，但無法在體外培養(yǎng)中大量增殖，抗原來源量有限，因而限制了其在免疫預(yù)防中的廣泛應(yīng)用。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，EG95蛋白抗原是六鉤蚴組成成分中理想的疫苗抗原候選分子，Lightowlers等人利用EG95蛋白抗原成功研制了羊細(xì)粒棘球病EG95基因工程亞單位疫苗，免疫羊?qū)?xì)粒棘球絳蟲蟲卵感染的保護(hù)率可以達(dá)到96％，是目前控制羊棘球蚴病的唯一疫苗(Lightowlers MW,Lawrence SB,Gauci CG,et al.Vaccination against hydatidosis using a definedrecombinant antigen.Parasite Immunol,1996,(18):457-462)。但現(xiàn)有的重組EG95重組蛋白疫苗抗原使用大腸桿菌生產(chǎn)的GST融合蛋白，其表達(dá)產(chǎn)物以不可溶的包涵體形式存在，難以維持蛋白的天然結(jié)構(gòu)，也缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾過程，從而影響了疫苗的免疫保護(hù)效果，且由于內(nèi)毒素難以去除而導(dǎo)致免疫副反應(yīng)大等弊端。

賈萬忠等人成功在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)了EG95蛋白的分泌性表達(dá)，蛋白濃度和目的蛋白純度都較理想(專利：細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白的修飾及在酵母中的表達(dá)，ZL201210103512.1)。但是，該酵母表達(dá)系統(tǒng)是以醇氧化酶(AOX)為啟動子的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，只有以甲醇作為唯一碳源時，才能表達(dá)和分泌外源蛋白。然而，甲醇是一種有毒物質(zhì)，并且易燃、易爆，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中存在安全隱患。同時，發(fā)酵過程中很容易出現(xiàn)甲醇的蒸發(fā)，對環(huán)境構(gòu)成威脅，并且也會引起甲醇在發(fā)酵產(chǎn)物中的殘留，容易對免疫動物的健康造成危害。此外，在高密度發(fā)酵過程中，把碳源從甘油更換到甲醇也很不方便，且發(fā)酵周期長。而畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)以三磷酸甘油醛脫氫酶(pGAP)為啟動子，該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時不需要把碳源從甘油更換成甲醇，從而避免了使用甲醇時存在的諸多弊端，更適合大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白。并且在高密度發(fā)酵時采用連續(xù)發(fā)酵模式，表達(dá)時間短，大大縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率，因此，畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)已成為近年來研究和開發(fā)的熱點和方向。

發(fā)明內(nèi)容