[發明專利]一種酶活性提高的重組溶菌酶LYZ-2及其突變體和應用

有效

• 申請號: 202011046867.2
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112111474B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 肖志壯;薛海曌;于文君;方安然;付五兵;張大偉;呂偉;楊玉超
• 申請（專利權）人: 青島紅櫻桃生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23K20/189;A23K50/30;A23K50/75;A23K50/60;C12R1/84
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了一種酶活性提高的重組溶菌酶LYZ?2及其突變體和應用。本本發明優化了天然溶菌酶的基因序列，并在此基礎上利用易錯PCR方法進行了隨機突變，獲得了重組溶菌酶LYZ?2及溶菌酶突變體LYZ?2?m，其酶活均得到了顯著的提高。本發明得到的重組溶菌酶LYZ?2及溶菌酶突變體LYZ?2?m能夠添加到養殖動物的飼料中，改善動物的生長狀況，提高了成活率。本發明為基因工程方法規模化生產溶菌酶奠定了理論與實踐基礎，并且本發明得到的溶菌酶性質良好，在養殖行業有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種酶活性提高的重組溶菌酶LYZ-2及其突變體和應用。

背景技術

溶菌酶(lysozyme，LYZ)又稱胞壁質酶、N-乙酞胞壁質聚糖水解酶，能水解細菌細胞壁的肽聚糖引起細胞裂解，水解位點是N-乙酞葡萄糖胺和N-乙酞胞壁酸之間的3，4-糖苷鍵。溶菌酶是由英國生物學家Flemin于1922年在人體內首次發現，因其能明顯溶解細菌細胞壁，故命名為溶菌酶。

自然界中溶菌酶來源廣泛，根據其生物來源可以分為4種類型：動物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌體T4溶菌酶。溶菌酶能溶解微生物細胞壁使其失去生理活性，具有抑菌、抗病毒和消炎作用，同時還是人體內的非特異性免疫因子，可提高機體的免疫力。另外，溶酶菌本身是天然蛋白質，能在胃腸道作為營養物質消化、吸收，無毒性，也不在體內殘留，在食品保鮮、營養保健、醫藥、化妝品、飼料及基因工程研究領域均有重要應用。

目前市售溶菌酶主要是從雞蛋清中提取得到的，但因原料受限且含量較少，提取純化過程步驟繁瑣，導致溶菌酶產量低、成本高。而化學方法合成溶菌酶的成本極為昂貴，也會限制溶菌酶的應用。采用基因工程的手段構建溶菌酶的表達宿主，并通過大規模發酵實現溶菌酶的工業化生產，成本低廉、操作簡單，為溶菌酶大規模應用提供廣闊的前景。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種酶活性提高的重組溶菌酶LYZ-2及其突變體和應用。本發明利用基因合成的方法將果蠅溶菌酶的天然序列優化得到了重組溶菌酶LYZ-2的編碼基因，同時通過易錯PCR的方法對LYZ-2的編碼基因進行隨機突變獲得突變體LYZ-2-m的編碼基因，以此得到的重組溶菌酶酶活得到了顯著提升；本發明的另一目的在于提供了包含重組溶菌酶LYZ-2和其突變體LYZ-2-m基因的重組表達載體，然后將其轉入畢赤酵母感受態細胞中篩選得到活性高、熱穩定性好的轉化子，最終能夠用于大規模的溶酶菌發酵生產，誘導發酵產生的溶菌酶活性高、耐熱性好，適合應用于動物養殖中。

本發明的另一目的在于提供了上述重組溶菌酶LYZ-2和其突變體LYZ-2-m在制備養殖動物飼料添加劑中的應用，所述的動物為家禽和家畜。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了一種酶活性提高的重組溶菌酶LYZ-2，所述的重組溶菌酶LYZ-2的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本發明還提供了所述的重組溶菌酶LYZ-2的編碼基因，所述的重組溶菌酶LYZ-2的編碼基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供了一種溶菌酶突變體LYZ-2-m，所述的溶菌酶突變體LYZ-2-m的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，其是由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的重組溶菌酶LYZ-2的第93位氨基酸由丙氨酸變為苯丙氨酸獲得。

本發明還提供了所述的溶菌酶突變體LYZ-2-m的編碼基因，所述的溶菌酶突變體LYZ-2-m的編碼基因序列如SEQ ID NO：3所示。

進一步的，所述的重組溶菌酶LYZ-2最高發酵酶活為622632U/mL。

進一步的，所述的溶菌酶突變體LYZ-2-m的最高發酵酶活為618372U/mL。