[發明專利]檳榔芋軟腐病的生防細菌篩選方法

在審

• 申請號: 202011033242.2
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111405A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 董曉菲;周銀珠;阮俊峰;葉祖云;劉盛榮
• 申請（專利權）人: 寧德師范學院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12N1/04;C12Q1/04;C12Q1/18;C12Q1/689
• 代理公司: 北京權智天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11638
• 代理人: 李海燕

1.檳榔芋軟腐病的生防細菌篩選方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

S1、準備樣品以及培養基

準備土樣，其中土樣取深度為10-15cm的健康檳榔芋植株根際土壤，帶回備用，培養基為NA培養基；

S2、細菌的分離和保存

土樣分離、純化細菌：

稱取10g土壤放入盛有90mL無菌水并帶有20顆玻璃珠的150mL三角瓶中，振蕩10min，即稀釋度為10^-1的土壤懸浮液，吸取1mL的10^-1土壤懸浮液放入盛有9mL無菌蒸餾水的試管中，充分混勻，以此類推，再稀釋成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀釋液，分別吸取上述稀釋液100μL均勻涂于NA培養基平板上，每個稀釋度涂布3皿，于37℃恒溫培養箱倒置培養24-48h；

待長出菌落后，根據平板上長出菌落的形態顏色、質地等性狀挑取不同的單菌落，純化后接斜面試管4℃保存備用；

S3、生防細菌的離體球莖篩選

將分離純化出的細菌和軟腐病病原細菌分別接種于NA液體培養基中，于37℃、220r/min恒溫搖床中培養8h備用。選取健康檳榔芋頭，水洗并風干，切成約3×3×0.7cm的芋塊，放入75％乙醇中消毒30s，再用0.1％升汞消毒5mins，無菌水充分洗滌5次，放入有濾紙的無菌培養皿中，每皿放入一組織塊，備用。將軟腐病病原菌液和待測菌液以1∶1比例混合，用無菌刀在芋塊中央劃深0.3cm十字傷口，將20μL混合菌液接種于十字傷口中。其中無菌水為陰性對照，軟腐病病原菌液為陽性對照，重復3次，置于37℃恒溫箱培養7d，觀察記錄病狀。

S4、平板拮抗試驗

1)濾紙法平板拮抗篩選：將100μL病原菌菌液涂布于NA培養基平板上，37℃恒溫倒置培養24h，待長出菌苔后，再用5mm浸透生防細菌發酵液的濾紙，貼在菌苔上，每一皿等距放5片，以浸有無菌水的濾紙為空白對照，重復3次，37℃恒溫培養1-2d，觀察抑菌圈的有無及大小；

2)發酵菌液平板拮抗篩選：將100μL病原菌發酵液涂布于NA培養基平板上，37℃恒溫倒置培養24h，待長出菌苔后，用直徑為8mm的打孔器均勻打5個孔，取待測生防細菌發酵液注入孔中，以注入無菌水為空白對照，重復3次，37℃恒溫培養1-2d，觀察抑菌圈的有無及大小；

3)無菌發酵濾液平板拮抗篩選：將100μL病原菌發酵液涂布于NA培養基平板上，37℃恒溫倒置培養24h，待長出菌苔后，用直徑為8mm的打孔器均勻打5個孔，將待測生防菌發酵液7000r/min離心10min去除菌體，取上清液用細菌過濾器過濾除菌，得到無菌發酵液，在打孔處加入無菌發酵液，以注入無菌水為空白對照，重復3次，37℃恒溫培養1-2d，觀察抑菌圈的有無及大小；

S5、菌株16SrDNA分子鑒定

用細菌DNA提取試劑盒提取DNA后，用細菌通用引物進行PCR擴增，PCR產物委托公司測序，將測序所得的結果用DNAMAN進行序列分析，在NCBI上進行BLAST對比，用MEGA5構建系統進化樹，確定菌種；

S6、菌株形態觀察及主要生理生化特征

形態觀察：菌落平板觀察(形狀、顏色、質地等)和光學顯微鏡下革蘭氏、芽孢、鞭毛染色等觀察；

生理生化：分別對細菌的需氧型、接觸酶、明膠水解、淀粉水解、葡萄糖發酵、甘露醇發酵、V-P、吲哚、苯丙氨酸脫氨酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原等于37℃恒溫培養后觀察結果，最適pH(pH＝5-10)、最適溫度(4℃、20℃、30℃、37℃、41℃、45℃、65℃)等于恒溫培養菌液48h，每隔8h測一次菌液OD值，同時觀察細菌生長狀況，上述試驗均做3次重復，上述生理生化試驗具體如下：

1)需氧型：用無菌接種針將菌種豎直穿刺接種于NA培養基中，于37℃恒溫培養24h，觀察結果僅在試管瓊脂柱表面生長的為好氧性菌，在瓊脂柱表面和沿穿刺線都生長的為兼性厭氧菌，僅在試管底部生長的為厭氧性菌；

2)接觸酶：接種在NA培養基后，37℃恒溫培養24h。在載玻片滴加3％過氧化氫，再將新培養的菌種涂在該玻片上，如果觀察到有氣泡產生是陽性，沒有氣泡是陰性；

3)明膠水解：培養基蛋白胨5g，明膠100g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.4。穿刺接種后在20℃以下室溫中觀察培養7天后的菌株，如果菌生長同時明膠表面為穩定凝塊且無凹陷，則是明膠水解陰性。如果明膠凝塊有可流動的液體，則是明膠水解陽性；

4)淀粉水解：在肉汁胨培養基中加0.2％可溶性淀粉，將新培養24h的菌種接在上述培養基平板上，37℃恒溫培養5天，在形成明顯的菌落時滴加碘液后出現藍黑色，如果菌落周圍出現不變色的透明圈的為淀粉水解陽性，如果還是藍黑色為陰性；

5)葡萄糖發酵和甘露醇發酵：培養基(NH₄)₂HPO₄(1.0g)，KCl(0.2g)，MgSO₄(0.2g)，酵母膏(0.2g)，瓊脂(5.0g)，葡萄糖或甘露醇(10.0g)，蒸餾水(1000mL),pH7.0-7.2。將菌種穿刺接種，培養5天后觀察，滴0.04％溴甲酚紫指示劑變黃者，表示產酸為陽性，不變或變藍為陰性；

6)V-P：接種在葡萄糖蛋白胨水培養基后37℃恒溫培養兩天，滴5-10滴40％KOH，振蕩，再滴加等量5％α-萘酚溶液，振蕩，最后放入37℃溫箱中15-30min。觀察和記錄顏色變化，變紅色為陽性；

7)吲哚：把培養24h的菌種接種在蛋白胨水培養基中，37℃恒溫培養48小時后，滴加3-4滴乙醚，搖動，靜置3分鐘，出現分層時再加2滴吲哚試劑，若三層的中間層產生紅色環狀物的是陽性反應；

8)苯丙氨酸脫氨酶：培養基酵母膏(3g)，NaCl(5g)，Na₂HPO₄(1g)，瓊脂(12g)，DL-苯丙氨酸(1g)，蒸餾水1000mL，pH7.0，在37℃的恒溫箱中培養4h，滴4-5滴10％的FeCl₃溶液，如果產生綠色的為陽性反應，不變則為陰性；

9)檸檬酸鹽利用:培養基NaCl(1.0g)，MgSO₄·7H₂O(0.2g)，NH₄H₂PO₄(0.5g)，檸檬酸鈉(2.0g)，蒸餾水(1000mL)，接種后于37℃恒溫培養7天后，滴0.04％酚紅液，如果觀察到變為藍或桃紅色的是陽性，否則是陰性。

10)硝酸鹽還原：培養基KNO₃(1g)，肉汁胨培養基1000mL，pH7.0-7.6。A液：對氨基苯磺酸(0.5g)、稀醋酸(150mL)；B液：α-萘胺(0.1g)、蒸餾水(20mL)、稀醋酸(150mL)。二苯胺試劑：二苯胺0.5g溶于100mL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。將菌接種在上述培養基中，室溫培養3-5天后，向培養液中滴A液和B液，溶液變紅或橙色表示亞硝酸鹽存在，為陽性反應；如果沒出現紅或橙色時再加1-2滴二苯胺試劑，此時出現藍色表示沒有硝酸鹽還原作用，如不出現藍色表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都還原成其他物質，是陽性；

S7、生防細菌的田間活體防效試驗

將田里的檳榔芋松土并適量挖根部土，使其球莖部分露出，選擇健康植株球莖，對其表面做清潔處理，將無菌細尖剪刀用75％酒精浸泡后，至酒精燈火焰處焙干，冷卻后扎入球莖并旋轉形成一圓柱傷口，菌液分別為病原菌液(對照)、病原菌和生防菌1:1混合液，用針筒吸取菌懸液緩慢打入傷口中，用細菌過濾膜密封，覆土并做好標記，使用過的剪刀和針筒不再重復使用，14d后觀察球莖得發病情況。