[發明專利]重組腺相關病毒純化方法

有效

• 申請號: 202011027051.5
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112226418B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 周豪杰;王晨旭;高傳玉;張守濤;馬強
• 申請（專利權）人: 阜外華中心血管病醫院
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12N7/00
• 代理公司: 鄭州盈派知識產權代理事務所(普通合伙) 41196
• 代理人: 張曉輝;樊羿

本發明涉及一種重組腺相關病毒純化方法。其主要包括第Ⅰ輪高pH（7.3～8.3）下的除雜純化和第Ⅱ輪低pH（4.0～4.5）下的病毒吸附及嚴格密集梯度洗脫的進一步純化。SDS?PAGE結果表明病毒純化效果顯著，第Ⅰ輪純化除去了大量的蛋白雜質，第Ⅱ輪純化也明顯除去部分雜質；WB和電鏡結果證明，純化產物實為rAAV病毒且滴度滿足需要，而且鏡檢表明包含基因的實心顆粒占比可達99%。本發明純化方法簡單方便、能有效去除空殼病毒，提高包含基因的實心病毒占比，且易于實現rAAV的大規模純化，為rAAV相關的臨床研究和藥物開發奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及病毒純化技術領域，具體涉及一種重組腺相關病毒純化方法。

背景技術

近幾十年來，隨著基因治療的有關研究不斷升溫，各種基因表達載體相繼被開發和應用，主要分為病毒載體和非病毒載體。非病毒載體主要包括裸質粒和脂質體DNA復合物等。雖然非病毒載體安全性高，但是它們轉染效率低，介導基因表達的時間短，無法滿足臨床基因治療的要求，所以現已基本被遺棄。常用的病毒載體包括：慢病毒、腺病毒、腺相關病毒（Adeno-associated Virus，AAV）和逆轉錄病毒。但是慢病毒會整合至宿主染色體進而帶來可能的安全隱患，腺病毒自身免疫原性較強，容易引發機體的免疫反應，一定程度上阻礙了其臨床應用，逆轉錄病毒因為隨機整合至宿主基因組的隱患和只能感染分裂細胞的限制，目前主要應用于體外實驗研究。

而AAV載體相比于其它病毒載體具有以下優勢：①安全性好，迄今尚未在人和動物中發現與AAV相關的疾病，85%以上的人群血清為AAV衣殼蛋白抗體陽性；②AAV是以位點特異性的方式整合在宿主基因組的病毒，避免了隨機整合導致宿主細胞基因突變的問題；③AAV的宿主范圍廣，不僅可以感染分裂細胞，還可以感染靜止期細胞；④rAAV攜帶的外源基因可以在宿主細胞長期穩定表達；⑤免疫原性低，重組腺相關病毒載體（Recombinantadeno-associated virus，rAAV）去除了野生型AAV自身的Rep和Cap基因，并不編碼會引起免疫反應的病毒蛋白；⑥不同類型的AAV具有不同的組織嗜性，針對特定的組織可以選擇更具組織特異性的AAV類型作為基因載體；⑦AAV還具有較好的熱穩定性和抗酸、堿及有機溶劑的特性，有利于AAV的純化。以上的這些優點，使AAV載體成為最有前景且最受歡迎的基因表達載體，在基因治療和藥物開發中備受關注。

隨著AAV生產和純化方法的不斷改進以及rAAV相關的動物實驗、臨床試驗的不斷開展，多種rAAV藥物已被廣泛應用于多種疾病的基因治療。rAAV的基因治療已經在很多疾病動物模型上獲得成功，如Leber先天性黑死病、Duchenne肌營養不良癥、血友病B和帕金森病等。隨著人們對rAAV載體的深入研究，將來可能發現更多、更安全、特異性更強、表達效率更高的rAAV載體。無論是開展動物實驗，還是臨床試驗，均需要大量符合生產質量管理規范（Good Manufacturing Practices，GMP）要求的高純度、高滴度的rAAV病毒載體。而rAAV的規?；b和純化是制約rAAV載體藥物研究快速發展的關鍵問題。

總體上，rAAV的包裝技術目前已比較成熟，而當前限制rAAV基因治療研究快速發展的主要問題在于rAAV的純化。所以，rAAV的基因治療亟需一種簡單高效、節約成本、可規?；膔AAV制備和純化方法，來推進rAAV載體藥物的研究進程。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種重組腺相關病毒純化方法，以解決腺相關病毒純化工藝復雜、純化效果難以滿足需要，且制備成本居高不下的技術難題。

在純化方法的選擇上，由于目前發展成熟且使用廣泛的密度梯度離心法不適合規模化生產，且操作要求高不易掌握；基于此，本發明研究路線選擇了更適合規模化生產且操作相對簡單的離子交換層析法進行rAAV的后期純化，但是將常規的離子交換層析法直接應用于rAAV的純化，則難以做到病毒空顆粒的分離以及病毒產量和純度之間的平衡。