[發明專利]重組腺相關病毒純化方法

有效

• 申請號: 202011027051.5
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112226418B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 周豪杰;王晨旭;高傳玉;張守濤;馬強
• 申請（專利權）人: 阜外華中心血管病醫院
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12N7/00
• 代理公司: 鄭州盈派知識產權代理事務所(普通合伙) 41196
• 代理人: 張曉輝;樊羿

1.一種重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，對收集的病毒懸液進行至少兩輪陽離子交換層析純化，其中，在第Ⅰ輪陽離子交換層析純化中設置pH為7.3～8.3的上樣液以吸附并去除病毒液中雜質蛋白；在第Ⅱ輪陽離子交換層析純化中，設置pH為4.0～4.5的上樣液以吸附rAAV病毒，再通過一定間隔的多pH梯度洗脫rAAV病毒，進行濃縮和Buffer置換后，收集滴度和純度滿足需要的梯度洗脫峰液，得純化的腺相關病毒；在第Ⅱ輪純化后，選定對應于pH5.48、pH5.72和/或pH5.86的洗脫峰液進行濃縮和Buffer置換，得rAAV純品。

2.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ輪陽離子交換層析純化中的上樣液的載液為pH7.8的檸檬酸鈉緩沖液。

3.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ輪陽離子交換層析純化中的上樣液的載液為pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

4.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ輪陽離子交換層析純化中的pH梯度洗脫依次采用pH5.31、pH5.48、pH5.72、pH5.86、pH 6.02、pH6.17的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

5.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ輪陽離子交換層析純化過程中，其離子交換柱選擇HiTrap SP HP或者分辨率較低的層析柱HiTrapSP FF 或HiTrap Capto S；第Ⅱ輪陽離子交換層析純化的離子交換柱選擇HiTrap SP HP或者分辨率更高的層析柱RSOURCE 15 S或RSOURCE 30 S，以進一步保證rAAV的純度。

6.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒純化方法，其特征在于，對所述洗脫峰液進行濃縮和Buffer置換的方法如下：

1）取100kDa截留分子量的超濾離心管，加入一定體積的PBS緩沖液后冰浴預冷5 min，然后4℃、2000 g條件下離心10 min，棄去離下液；

2）然后將對應的梯度洗脫峰液取一定體積加入超濾離心管，于4℃、2000 g條件下離心10 min，離心后棄去離下液；

3）重復步驟2）直至該洗脫峰所有液體全部加入超濾離心管離心通過濾膜；

4）然后向超濾離心管再加入一定體積的PBS緩沖液，于4℃、2000 g條件下離心10 min，至終體積1 ml，棄去離下液；

5）重復步驟4）兩次，最后一次離心，需要調整離心時間，濃縮至需要的終體積。