[發明專利]一種用于發酵法生產D-泛酸的菌株及發酵法生產D-泛酸的方法

有效

• 申請號: 202011015874.6
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN112195143B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 柳志強;鄒樹平;鄭裕國;牛坤;周海巖;王之見;趙闊
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種用于發酵法生產D?泛酸的菌株及發酵法生產D?泛酸的方法。所述菌株由將大腸桿菌serA基因、glyA基因中的至少一個克隆到保藏號為CCTCC NO：M2018914的大腸桿菌中進行過表達所得。本發明首次利用單因素實驗及響應面法優化方法對D?泛酸的發酵培養基進行優化，以D?泛酸產量為響應值，優化得到最佳的絲氨酸添加量以及最顯著的影響D?泛酸濃度的因素濃度。該方法擬合度好，實驗結果可靠。使用優化后的最佳培養基進行D?泛酸發酵，D?泛酸的產量提高至6.73g/L，是優化前的2.1倍。

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術領域，特別是涉及一種用于發酵法生產D-泛酸的菌株及發酵法生產D-泛酸的方法。

背景技術

D-泛酸又稱維生素B5，化學分子式C₉H₁₇NO₅，相對分子量219.24，是一種重要的水溶性維生素，廣泛的應用于醫藥、食品、飼料、以及化妝品等領域。D-泛酸普遍存在于生物體內，是酰基載體蛋白(ACP)和輔酶A(CoA)的重要合成前體之一，為所有細胞中的TCA循環提供了主要底物，并控制細胞生長，增殖和整體組蛋白乙酰化，以及在碳水化合物，脂肪酸，脂質和磷脂等多種重要物質的合成代謝和分解代謝途徑中起關鍵作用。D-泛酸可以提高機體免疫力并可與其他組分構成的復方制劑則用于治療神經炎、神經衰弱、術后腸絞痛、胃腸道疾病、呼吸道疾病、紅斑狼瘡、亨廷頓舞蹈病等皮膚疾病；同時D-泛酸還應用于多種保健食品，如成長快樂、施爾康和21金維他等，在食品領域，D-泛酸用于增強燒酒和威士忌風味；還具有防止冬天蜂蜜結晶和緩解咖啡因、糖精苦味等作用。對畜禽養殖業至關重要，若缺乏D-泛酸，家禽、家畜可能出現生長遲緩、適應性和抗病性下降、生殖系統障礙、毛發脫落色澤暗淡等現象。

現有的D-泛酸的工業化生產方法主要是化學-酶法，異丁醛與甲醛在堿性、高溫條件下羥醛縮合形成羥基特戊醛，再添加氫氰酸，在酸性條件下進行醇氰化反應形成氰醇；氰醇在酸性條件下通過水解環化得到DL-泛解酸內酯，DL-泛解酸內酯經L-泛解酸內酯水解酶水解，留下D-泛解酸內酯，產生的L-泛解酸再經化學內酯、外消旋轉為DL-泛解酸內酯。得到的D-泛解酸內酯與β-氨基丙酸鈣縮合直接制得D-泛酸鈣。現有的生產工藝對設備要求高、合成過程中存在的環境污染問題無法避免。隨著環保問題日益嚴峻，以綠色可再生資源為原料的微生物發酵法生產D-泛酸受到越來越多的關注。微生物發酵法條件溫和、環境友好、產品質量穩定，具有發展前途，同時由微生物進行酶促生產的優點是直接形成所需的立體異構體形式，即D-形式，其不含L-泛酸。現有的以微生物直接發酵法生產D-泛酸生產菌主要包括大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。

微生物發酵法通過微生物的代謝合成D-泛酸或其衍生物并分泌到發酵液中，發酵菌株主要代謝糖類物質(葡萄糖、麥芽糖等)。將含有碳源物質與無機氮源，無機鹽等物質的發酵培養基高溫殺菌后進行接種，發酵后分離純化發酵液得到D-泛酸鈣。現有的對微生物發酵法的研究主要集中于菌種構建以及代謝研究，但大腸桿菌生產D-泛酸仍然存在重大障礙。例如，雖然已經提出了許多可行的工程細菌構建方案，但是葡萄糖生產D-泛酸的轉化率仍然較低。

目前D-泛酸的發酵培養基培養基組分的組成與配比不合理。生物發酵所必須的碳源、氮源、無機鹽，代謝調節物質等的優化研究能進一步的提高菌體濃度與生物產物的合成。因此，本領域迫切需要改良D-泛酸生產菌的發酵培養基。

申請人前期的專利申請(公開號為CN109868254A的發明申請)中公開了一種高產泛酸的基因工程菌、構建方法及應用，通過強化D-泛酸生物生成途徑中關鍵酶panB，panC、panE和IlvC的表達，通過修復ilvG基因削弱反饋調控和強化泛解酸合成途徑，提高D-泛酸產量，使D-泛酸和纈氨酸在積累分別達到0.48g/L和0.51g/L，通過敲除avtA和敲降ilvE對競爭支路進行削弱得到一株無質粒高產菌，D-泛酸效價從0.48g/L提高到1.54g/L。但該技術方案中D-泛酸產量仍然較低。

發明內容