[發明專利]一種實現近共振增強的超分辨受激拉曼顯微成像方法及裝置

有效

• 申請號: 202010987124.9
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112240880B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 王平;畢亞麗;楊光;楊馳
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 武漢華之喻知識產權代理有限公司 42267
• 代理人: 廖盈春;曹葆青

本發明公開了一種實現近共振增強的超分辨受激拉曼顯微成像方法及裝置，包括(1)獲得兩束同步且相位鎖定的第一脈沖光源λ₁和第二脈沖光源λ₂；(2)對第一脈沖光源λ₁進行倍頻處理，對經過強度調制后的第二脈沖光源λ₂進行倍頻處理，實現將其波長減半并獲得第三脈沖激光λ₃和第四脈沖激光λ₄；(3)對第四脈沖激光λ₄進行延遲處理使其與第三脈沖激光λ₃實現時間域匹配，并對時間域匹配的第三脈沖激光λ₃和第四脈沖激光λ₄進行合束處理實現空間域的完全匹配；(4)將合束后的第三脈沖激光λ₃和第四脈沖激光λ₄同時耦合進入單模保偏光纖；(5)對由單模保偏光纖傳輸的光與樣本作用后產生的光信號進行處理，并獲得顯微圖像。本發明實現了空間分辨率的提高。

技術領域

本發明屬于生物醫學及光學成像技術領域，更具體地，涉及一種實現近共振增強的超分辨受激拉曼顯微成像方法及裝置。

背景技術

光學顯微成像技術已成為生物醫學研究的基石，能夠在研究細胞結構探測及功能的同時對感興趣的細胞或組織具有最小的侵入性。當前，熒光顯微鏡發展如日中天，基于熒光標記的顯微成像技術可以通過對外源標記分子的操控，間接實現包括蛋白質、核酸在內的多種生物分子的特異性超分辨成像。但是過大的熒光蛋白標簽會影響生物分子的活性，過寬的熒光譜線限制了多色標記的發展，且熒光的漂白特性未得到很好的解決。因此，急需免標記技術對細胞內活躍的生化反應、代謝活動以及小分子生物代謝產物進行高分辨的精確定位分析。

然而，由于光學衍射極限的限制，能應用于細胞或組織的超高分辨成像技術仍面臨巨大挑戰。近年來，能夠直接探測固有生物分子，產生圖像對比度的無標記高分辨顯微成像技術有了飛速的發展。包括紅外吸收顯微鏡和自發拉曼散射顯微鏡在內的無標記分子振動顯微鏡都可以利用分子固有的化學鍵振動成像，但是，波長較長的近紅外激發光限制了紅外吸收顯微鏡的空間分辨率，較低的成像靈敏度限制了自發拉曼顯微鏡的成像速度。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微鏡雖然有較高的成像靈敏度，但是受強非共振背景信號的干擾，CARS的光譜不同于自發拉曼光譜，這就導致了光譜的復雜化以及圖像解釋上的困難，同樣限制了檢測靈敏度。

隨著技術的發展，為了提高成像靈敏度，同時克服非共振背景的干擾，受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering，SRS)顯微成像技術逐漸成熟，該技術對生物體的成像速度更快，靈敏度更高。然而，SRS作為一種無標記分子振動成像技術，其空間分辨率一直被限制在300納米左右。因此，能夠突破180納米傳統空間分辨極限的無標記超高分辨光學成像一直是成像領域開拓的重要方向。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種實現近共振增強的超分辨受激拉曼顯微成像方法及裝置，旨在解決無侵入性的免標記光學成像領域，空間分辨率長期限制在300納米左右，無法對精細結構進行成像的問題。

本發明提供了一種實現近共振增強的超分辨受激拉曼顯微成像方法，包括下述步驟：

(1)獲得兩束同步且相位鎖定的第一脈沖光源λ₁和第二脈沖光源λ₂，并對所述第二脈沖激光λ₂進行正弦型強度調制；

(2)通過第一晶體對所述第一脈沖光源λ₁進行倍頻處理，通過第二晶體對經過強度調制后的第二脈沖光源λ₂進行倍頻處理，在保證重復頻率且偏振模式不變的條件下，實現將其波長減半并獲得同步且相位鎖定的第三脈沖激光λ₃和第四脈沖激光λ₄；