[發明專利]一種β-木糖苷酶及其應用

有效

• 申請號: 202010986885.2
• 申請日: 2020-09-18
• 公開（公告）號: CN112143745B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 張永輝;汪馳;陳培旭;肖安風;楊秋明;陳福泉;翁惠芬;肖瓊
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/24;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種β?木糖苷酶及其應用。本發明提供了一種編碼β?木糖苷酶的基因，β?木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，編碼β?木糖苷酶的基因的核酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發明提供的β?木糖苷酶具有耐酸性及熱穩定性，并且具有協助木聚糖酶水解木聚糖的能力，有利于其在生物質轉化過程中的使用。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種β-木糖苷酶及其應用。

背景技術

來自工業和農業活動中的具有木質纖維素組合物廢物的污染是主要的環境問題；然而，它們可以是低成本的可再生的起始材料，這種有價值的資源可以用于生產各種化學品和燃料，例如乙醇。為了利用廢料中多糖部分生產乙醇，這些木質纖維素需要有效地水解成木糖。

木糖可通過微生物如酵母和假絲酵母念珠菌的發酵將木糖轉化為乙醇，并且在啤酒生產過程中，由于生產原料中含有較高的β-葡聚糖及木聚糖，使得生產出來的啤酒會出現酒液混濁，啤酒濾膜堵塞等一系列問題，影響啤酒的質量，同時也使啤酒生產成本提高。通過研究發現利用β-木糖苷酶等酶，可解決上述出現的一些問題，提升啤酒品質，降低啤酒生產成本，因此木β-木糖苷酶在啤酒釀造行業具有潛在的應用前景。

目前，工業化β-木糖苷酶的生產主要通過傳統固態發酵和液態發酵兩種方法，相比于液態發酵，固態基質中水不溶性成分高，為微生物尤其是絲狀真菌提供了良好的附著位點，微生物生長環境良好，酶產量高且酶系豐富。但固態發酵存在一些不可避免的缺點，例如發酵過程中產生過多次級代謝產物，為后期純化帶來困難。基于固態發酵的缺陷，利用畢赤酵母液態發酵異源表達β-木糖苷酶可有效解決上述問題。

然而，現有的β-木糖苷酶的適應pH值在偏酸和中性范圍內，對溫度的耐受也僅在50℃以下。這使得β-木糖苷酶在能源轉化，尤其是生物酒精發酵的過程中受限制。因此發現新型的耐酸耐高溫的β-木糖苷酶對工業生產具有重要意義。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術中的技術問題之一。本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術中的技術問題之一。

在本發明的第一方面，本發明提出一種編碼β-木糖苷酶的基因，所述β-木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述基因的核酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發明基于PCR的方法克隆了β-木糖苷酶Ao-Xyl的核酸序列，序列分析結果表明，β-木糖苷酶結構基因全長2616bp，前57位為信號肽編碼序列，無內含子序列。

根據本發明的實施例，該β-木糖苷酶Ao-Xyl包括870個氨基酸和一個終止密碼子，N端分析前19位氨基酸為信號肽序列，去除信號肽后，成熟的β-木糖苷酶的理論分子量為94.51kDa。本發明獲得的β-木糖苷酶具有生物活性，酶活力為481.03U/mL，并且具有較好的耐酸性和耐熱性；其最適pH值為5.5，在pH?3～7的范圍內穩定；最適溫度為50℃，在60℃以下范圍內具有較高的酶活力。

在本發明的第二方面中，根據本發明實施例，提供了一種表達載體，其包含上述編碼β-木糖苷酶的多核苷酸。其中，多核苷酸為DNA序列。

在本發明的第三方面中，根據本發明實施例，提供了一種重組菌株，由前述表達載體轉化宿主細胞獲得。其中，宿主細胞采用畢赤酵母SMD1168。

在本發明的第四方面，本發明提出了一種制備β-木糖苷酶的方法，其包括下列步驟：

1)以米曲霉基因組DNA為模板，通過設計特異性引物，利用PCR的方法擴增β-木糖苷酶基因序列；其中，米曲霉的保藏編號為CCTCC?NO:M2019357，保藏名稱為米曲霉Aspergillus?oryzae?sp.FJ0123；

2)將所述β-木糖苷酶基因克隆到質粒中，得到上述表達載體；

3)將所述表達載體轉化宿主細胞，得到上述重組菌株；