[發明專利]多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202010981014.1
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112011632A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 劉少寧;李有志;徐恩民;陳智;劉霄飛;王艷芬;馬艷芳;趙向陽
• 申請（專利權）人: 山東省獸藥質量檢驗所（山東省畜產品質量檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12N1/04
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了多粘菌素耐藥基因mcr?4的RPA檢測引物組、試劑盒和方法。涉及分子生物學技術領域。包括1對引物和1個探針，并提供了檢測試劑盒和非診斷治療的檢測方法和引物組的應用。本發明僅需具備溫控功能的熒光檢測儀器，可在39℃條件下對mcr?4進行快速、實時、靈敏、準確、便捷的檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，更具體的說是涉及多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組、試劑盒和方法。

背景技術

多粘菌素是聚陽離子多肽類藥物，對革蘭氏陰性耐藥菌引起的感染具有良好的療效，尤其是在耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)等超級耐藥菌的治療上，常作為最后一道防線類藥物。2016年，由質粒介導的多粘菌素耐藥基因mcr-1被發現，且被證明其可在不同菌株間進行水平轉移，引起了全世界的廣泛關注。多粘菌素在醫學臨床、畜牧業及農業上使用量的逐年增加，以及不合理用藥情況，給公共衛生安全和畜牧業發展構成了嚴重威脅。目前，mcr基因家族的其它基因(mcr-2-8)也陸續被報道。已有的研究表明mcr-1、mcr-2和mcr-3基因在我國檢出率較高，mcr-4基因檢出率較低。檢測方法大多采用常規PCR、Sanger測序、熒光定量PCR和LAMP等方法。這些技術有的耗時耗力，有的靈敏度低，有的需要借助于大型精密儀器。進一步確認mcr-4基因在我國畜禽養殖中的存在情況，值得深入研究。

因此，如何提供一種檢測多粘菌耐藥基因mcr-4的方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組、試劑盒和方法。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度約37℃。其原理是：重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。

RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。需要注意的是與PCR引物不同，RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基；且在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素；RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟，需要自己摸索條件進行優化。

本發明驗證了檢測的靈敏度和特異性，并成功檢測了待檢株中的mcr-4核酸。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組，包括1對引物和1個探針，引物和探針如下：

mcr-4-F1：5’-CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATT-3’，SEQ ID NO 1；

mcr-4-R3：5’-AGCAATACTTGGTCAAAACAATATTGGCCAGAA-3’，SEQ ID NO 2；

探針mcr-4-probe：5’-TCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGTTTATAATGATTCTGGCTC-3’，SEQ ID NO 3；

其中，離5’端堿基數27bp的胸腺嘧啶T由FAM熒光基團標記；離5’端堿基數28bp的T和29bp的A之間插入四氫呋喃分子；離3’端堿基數15bp的T由熒光淬滅基團BHQ標記。