[發明專利]多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202010981014.1
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112011632A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 劉少寧;李有志;徐恩民;陳智;劉霄飛;王艷芬;馬艷芳;趙向陽
• 申請（專利權）人: 山東省獸藥質量檢驗所（山東省畜產品質量檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12N1/04
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種多粘菌素耐藥基因mcr-4的RPA檢測引物組，其特征在于，包括1對引物和1個探針，引物和探針如下：

mcr-4-F1：5’-CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATT-3’，SEQ ID NO 1；

mcr-4-R3：5’-AGCAATACTTGGTCAAAACAATATTGGCCAGAA-3’，SEQ ID NO 2；

探針mcr-4-probe：5’-TCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGTTTATAATGATTCTGGCTC-3’，SEQ IDNO 3；

其中，離5’端堿基數27bp的胸腺嘧啶T由FAM熒光基團標記；離5’端堿基數28bp的T和29bp的A之間插入四氫呋喃分子；離3’端堿基數15bp的T由熒光淬滅基團BHQ標記。

2.一種基于權利要求1所述引物組的檢測試劑盒，其特征在于，包括：凍干粉、去離子水、聚乙二醇、10μmol/L的mcr-4-F1、10μmol/L的mcr-4-R3，10μmol/L的探針和280mmol/L的醋酸鎂溶液。

3.如權利要求2所述的的檢測試劑盒，其特征在于，所述凍干粉由以下成分：220ng/μL重組酶RecA 11μg、200ng/μL單鏈DNA結合蛋白gp32 10μg、100ng/μL DNA聚合酶IKlenow 5μg、70ng/μL輔助蛋白uvsY 3.5μg、80ng/μL核酸外切酶exoIII 4μg、3％聚乙二醇1mg、30mMTris 0.12mg、120mM乙酸鉀0.49mg、3mM ATP 0.05mg、50mM磷酸肌酸二鈉鹽0.51mg、275μMdNTP 250μM、6％蔗糖2.5mg和30％甘油1mg經冷凍干燥制得。

4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，反應體系為50μL，將所述凍干粉和去離子水28.4μL，聚乙二醇12.5μL、10μmol/L的mcr-4-F1 2μL、10μmol/L的mcr-4-R3 2μL，10μmol/L的探針0.6μL，模板DNA 2μL和280mmol/L的醋酸鎂溶液2.5μL混合。

5.一種非診斷目的多粘菌耐藥基因mcr-4的RPA檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

(1)提取待測樣品的DNA為模板；

(2)利用權利要求1所述引物組或權利要求2或3所述試劑盒進行快速擴增及實時熒光檢測。

6.如權利要求5所述的一種非診斷目的多粘菌耐藥基因mcr-4的RPA檢測方法，其特征在于，擴增程序為：39℃恒溫反應20min。

7.如權利要求6所述的一種非診斷目的多粘菌耐藥基因mcr-4的RPA檢測方法，其特征在于，檢測設備為RPA擴增檢測儀或熒光定量PCR儀。

8.權利要求1所述引物組在制備檢測多粘菌耐藥基因mcr-4的試劑盒中的應用。