[發明專利]多重檢測呼吸道病毒核酸的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202010980496.9
• 申請日: 2020-09-17
• 公開（公告）號: CN112063756B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 蔣析文;黃桃生;李欣鈺;黃志文;林衛萍
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發明提供了多重檢測呼吸道病毒核酸的方法及試劑盒，具體地本發明公開了一種基于實時熒光定量PCR技術平臺，多重檢測H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒，2019?nCoV OFR1ab、N基因及人源內標基因GAPDH的方法、引物、探針及其試劑盒，具有檢測操作簡單、絕對定量、靈敏度高、特異性強及重復性好等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術和腫瘤診斷領域，具體地說，本發明涉及一種基于實時熒光定量PCR檢測技術平臺，定性檢測人鼻咽拭子、咽拭子、痰液等樣本中甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠狀病毒核酸檢測的方法、引物、探針及包括該引物探針混合液的試劑盒。

背景技術

甲型流感病毒是由A型流感病毒(Influenza A)引起的一種人畜共患的疾病綜合癥。禽類感染Influenza A后，可出現從亞臨床癥狀到輕度上呼吸道癥狀、委頓、乃至全身致死性疾病綜合征。目前已有許多甲型流感病毒如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9等由禽類傳播到人類中，死亡率極高，導致嚴重的公共衛生事件，不同型別的毒株感染在臨床癥狀上高度類似，并且與造成流感樣癥狀的其他病原也難以區別。監測是確定甲型流感流行株、發現變異株、預測和防控疫情的基礎。因此，建立快速、準確、簡單、高靈敏度的檢測方法顯得尤為迫切。

乙型流感病毒(Influenza B virus)是流感的主要病原之一，主要經飛沫及接觸傳播，人群普遍敏感。乙型流感病毒引起的癥狀特點是起病急驟，畏寒、發熱，體溫在數小時至24小時內升達高峰，39-40℃甚至更高；伴頭痛，全身酸痛，乏力，食欲減退；呼吸道癥狀較輕，咽干喉痛，干咳，可有腹瀉；顏面潮紅，眼結膜外眥充血，咽部充血，軟腭上有濾泡。乙型流感病毒根據抗原特性和血凝素(HA1)基因的核酸序列，可以分為不同的譜系。病毒大多數的譜系在自然選擇中消失，目前演變成抗原性差異較大的兩大譜系，分別稱為Yamagata系和Victoria系(簡稱為Y系和V系)。

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)，為不分節段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Corona viridae)正冠狀病毒亞科(Orthocoronamirinae)，根據血清型和基因組特點冠狀病毒亞科被分為四個屬。該病毒對熱敏感，56℃30分鐘、75％乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯已定不能有效滅活病毒。臨床癥狀以發熱、乏力、干咳為主要表現。鼻塞、流涕等上呼吸道癥狀少見。約半數患者多在一周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。值得注意的是重癥、危重癥患者病程中可為中低熱，甚至無明顯發熱部分患者起病癥狀輕微，可無發熱，多在1周后恢復多數恵者預后良好，少數患者病情危重，甚至死亡。

甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠狀病毒均為呼吸道病毒。甲型流感病毒和乙型流感病毒是最常見的流感病原，感染者初期癥狀與2019新型冠狀病毒感染癥狀極為相似，均會表現出發熱、咳嗽等癥狀，因此難以從臨床癥狀對患者進行準確的鑒別診斷。

目前，甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠狀病毒核酸常用的檢測方法包括基于熒光PCR技術的單一病原體的檢測技術、高通量測序法、恒溫擴增等，熒光PCR技術檢測特異性高、靈敏度強操作較為簡單，但在對多個病原同時進行檢測時常需分管進行針對性檢測，不同病原體PCR擴增條件可能存在一定的差異，因此臨床應用時需逐一排查，導致病原確定的周期加長，高通量測序技術雖然可同時對多種未知序列進行檢測，但存在檢測周期長、成本高昂且操作復雜、數據解讀難等問題，而恒溫擴增技術雖然檢測時間短，但其檢測設備并不成熟，臨床試劑應用時需增夠新型儀器才能進行配套檢測。

因此，本領域迫切需要開發能夠高效率檢測、鑒別臨床常見呼吸道病毒的方法以滿足臨床的需求。另外，有報道表明現有的臨床使用的核酸檢測試劑盒存在準確率較低的問題，因此需要開發具有較高的臨床檢測準確率的試劑盒產品。

發明內容