[發(fā)明專利]一種茄子高效再生體系的建立方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010969831.5
• 申請日: 2020-09-15
• 公開（公告）號: CN112042542A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 張愛冬;尚靜;查丁石;吳雪霞;朱宗文
• 申請（專利權）人: 上海市農業(yè)科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 鄭州歐凱專利代理事務所(普通合伙) 41166
• 代理人: 王志興

1.一種茄子高效再生體系的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1材料與方法：

S11試驗材料的選擇：

供試茄子材料為上海市農業(yè)科學院設施園藝所選育的高代自交系1-1#、1-2#、4#和8#；

S12種子滅菌與接種：

將種子在水中浸泡5個小時充分吸收水分，隨后放入55℃的水浴鍋中浸種20分鐘，取出浸種后的種子，先用75％的酒精表明消毒30秒，在超凈工作臺中用無菌水清洗一次，隨后加入20％(v/v)的次氯酸鈉(NaClO)溶液，深層消毒20分鐘，用無菌水清洗3次，倒掉無菌水，將消毒好的種子倒在滅菌過的濾紙上，將水吸干，將種子移入MS培養(yǎng)基上，先避光催芽，在種子露白后將其移至溫度25±1℃、光照周期16h/8h、光照強度2000-3000Lx的光照培養(yǎng)箱內生長；

S13誘導培養(yǎng)基的篩選：

在生長箱中長至兩片子葉完全展開時，在超凈工作臺上將其從組培瓶中取出，在滅菌后的濾紙上，將其子葉切成大約5mm×5mm的小塊，下胚軸切成約1cm的小段，并移至不同配方的誘導培養(yǎng)基上，子葉正面朝上，下胚軸橫向放置，于溫度25±1℃、光照周期16h/8h、光照強度2000-3000Lx的光照培養(yǎng)箱內生長，每兩周繼代一次，于四周后統計愈傷生長情況；

S14再生分化培養(yǎng)基的篩選：

待四周誘導培養(yǎng)后，將長出的愈傷組織移至不同的再生分化培養(yǎng)基，再生分化培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基的基礎上分別加入0.5mg/L、1mg/L和1.5mg/L的ZT，兩周繼代一次，于4-6周對生芽情況進行統計；

S15生根培養(yǎng)基的篩選：

待愈傷組織長出不定芽后，當葉片長出2-4片真葉時，將其自基部切下，分別轉接于1/2MS、MS、1/2MS+0.1mg/L NAA、1/2MS+0.1mg/L IAA的培養(yǎng)基上，對生根情況進行觀察統計；

S2結果與分析：

S21外植體誘導培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選：

對移至不同誘導培養(yǎng)基上的愈傷生長進行調查統計，結果顯示，不同的誘導培養(yǎng)基都可以誘導愈傷的產生，但對其誘導效果上存在顯著差異，在0.1mg/L的NAA存在的YD-1至YD-3培養(yǎng)基上，愈傷初期效果較好，但后期開始長根，且生長出的根愈傷化較嚴重，隨著6-BA濃度的增加，長根的數量逐漸減少，但產生的愈傷則逐漸致密，由此看出不同的激素比例對根生長誘導效果產生很大影響；

S22不同取材部位對愈傷形成的影響：

下胚軸在誘導培養(yǎng)基上生長時，部分表面形成非常疏松的愈傷組織，部分形態(tài)學頂端向上翹起，會形成叢生的芽，形態(tài)學下端會膨大，形成較為致密的愈傷，子葉誘導的愈傷，前期子葉向上拱起，背面先開始愈傷化，逐漸膨大，形成不同類型的愈傷組織，子葉產生的愈傷組織，主要分為三種類型，第一種愈傷為非常致密的深綠色，下胚軸的下部及部分子葉會產生這種愈傷，這種愈傷的子葉產生芽的概率較低；第二種愈傷呈現淡黃色或淡綠色，能夠分化出大量芽；第三種愈傷呈白色，非常疏松，幾乎很難產生芽，不同的誘導培養(yǎng)基對三種愈傷的誘導存在差異，大部分的誘導培養(yǎng)基都有可能產生這三種類型愈傷，只是比例存在差異，大部分的誘導培養(yǎng)基產生的都是第二種類型的愈傷，而YD-2和YD-3培養(yǎng)基主要產生第一種類型的愈傷；

S23不同基因型對愈傷誘導效果的影響；

對產生的愈傷組織進一步分析后發(fā)現，YD-4(87.495％)、YD-7(84.62％)和YD-10(97.44％)對1-1#材料的誘導效果較好，YD-7(96.155％)和YD-8(92.86％)對1-2#材料的誘導效果較好，YD-7(94.87％)、YD-9(91.11％)和YD-10(92.31％)都對4#材料有較好的誘導效果，YD-1(93.14％)和YD-7(96.155％)對8#材料有較好的誘導效果，綜上所述，我們認為YD-7愈傷誘導的培養(yǎng)基在這十種培養(yǎng)基中具有最好的誘導效果，且具有較廣泛適用性；

S24再生分化培養(yǎng)基的篩選：

挑選生長良好的愈傷組織，將其放在含不同濃度ZT的MS培養(yǎng)基上，對其生芽及后期芽生長情況進行檢測，發(fā)現與含有0.5mg/L和1.5mg/L ZT的培養(yǎng)基相比，含1mg/L ZT的MS培養(yǎng)基對芽的誘導率更高，而且下胚軸的誘導率明顯高于子葉，隨著芽的生長，子葉誘導的芽后期極易玻璃化，不易產生正常生長的葉片，通過對產生的正常芽及畸形芽的結果進行統計，發(fā)現含1mg/L ZT的培養(yǎng)基上畸形苗數量明顯低于其他培養(yǎng)基，而下胚軸誘導的芽一般沒有玻璃化的出現，綜上所訴，MS+1mg/L ZT的培養(yǎng)基最適于芽的再生及分化，且下胚軸明顯優(yōu)于子葉；

S25生根培養(yǎng)基的篩選:

將長至2-4cm的芽切下移至不同的生根培養(yǎng)基上，通過對生根結果的觀察發(fā)現，在1/2MS+0.1mg/L NAA的培養(yǎng)基上，基部易重新分化形成致密愈傷，長出的根表面也多伴有愈傷化，粗而無規(guī)則形狀，MS、1/2MS、1/2MS+0.1mg/L IAA都能較好的誘導愈傷產生，1/2MS及1/2MS+0.1mg/L IAA都可誘導產生多條主根，多條側根，但具有一定偏好性，對于8#材料并未能誘導根的產生，或誘導產生根的時間較長，MS能快速且廣譜的適應各種材料，誘導產生多條主根，多條側根，根部生長健壯，適合移栽；

S26再生苗的移栽：

待再生苗長出數條主根及側根，將組培瓶蓋打開部分，并隨時間推移逐步全部打開，待幼苗適應后將其取出，洗掉根部培養(yǎng)基，移入土中。