[發明專利]一株深淵鹽生單胞菌13199及其CRISPR-Cas系統和應用

有效

• 申請號: 202010947118.0
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112159772B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 張道鋒;崔希雯;張愛華;黃建科;薛華朋
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/22;C02F3/34;B09C1/10;C12R1/01;C02F101/20
• 代理公司: 無錫蘇元專利代理事務所(普通合伙) 32471
• 代理人: 王清偉

本發明公開了一株深淵鹽生單胞菌13199，其保藏編號為CGMCC 1.17396，分類命名是：Salinimonas profundi。該菌株是深海來源的細菌新物種，含有一個特殊的CRISPR?Cas系統和大量的重金屬抗性基因。其Cas蛋白與經過一定程度功能研究的高質量蛋白質數據庫UniProtKB/Swiss?Prot中收錄的蛋白質序列同源性均低于65％，很可能具有不同的活性和特點。本發明的菌株Salinimonas profundi 13199及其CRISPR?Cas系統是開發利用CRISPR?Cas系統及進行相關研究的新穎材料，同時本發明的菌株在重金屬污染環境修復制劑方面有一定的應用前景。

技術領域

本發明涉及一株深海來源的細菌菌株，具體為一株含有CRISPR-Cas系統的深淵鹽生單胞菌13199及其CRISPR-Cas系統和應用。

背景技術

規律間隔成簇短回文重復序列及其相關蛋白(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats-CRISPR associated proteins, CRISPR-Cas）系統是原核生物基因組中一段特殊的DNA序列，發現于大約84%的古菌和47%的細菌中。一個完整的CRISPR-Cas系統包含三個功能元件：一系列Cas基因，一個前導區(Leader)和一個CRISPR陣列。

Leader一般位于CRISPR上游，是富含AT、長度為300～500bp的區域，被認為可能是CRISPR的啟動子序列。CRISPR陣列由多個短而高度保守的重復序列區(Direct repeat,DR)和多個間隔區(Spacer)組成。DR長度一般為21～37 bp，含有回文序列，可形成發卡結構，數量有時超過100個。重復序列之間被長度為26～72bp的Spacer隔開。Spacer區域由俘獲的外源DNA組成，類似免疫記憶，當含有同樣序列的外源DNA入侵時，可被細菌機體識別，并被剪切使之表達沉默，達到保護自身的目的。Cas基因通常形成一個操縱子，位于CRISPR陣列的上游，可編碼一系列Cas蛋白。目前發現的Cas蛋白包括Cas1～Cas13等多種類型。Cas基因與CRISPR共同進化，共同構成一個高度保守的系統。這些蛋白相互配合，共同完成Cas基因的表達、新Spacer的獲得、外源核酸的識別和降解等過程。

根據使用的CRISPR RNA（crRNA）效應蛋白復合物的類型，CRIPSR-Cas系統分為Class 1（使用多效應蛋白）和2（使用單一效應蛋白）兩個大類；根據Cas蛋白的組成和排布方式，又分為6個（I-VI）主要類型，并且不斷有新的類型被發現。Class 1包括I、III和IV三個類型，編碼多種蛋白發揮作用；Class 2包括II、V和VI三個類型，分別只編碼Cas9、Cas12和Cas13一種蛋白便可以實現多效應蛋白符合物的所有功能。標志性的Cas蛋白是區分不同CRISPR-Cas系統的主要依據之一，是行使剪切目標DNA/RNA功能的蛋白，例如：I型使用Cas3，II型使用Cas9，III型使用Cas10，IV型使用Csf1，V型使用Cas12/Cpf1，VI型使用Cas13。在這些主要的類型中，又分為諸多亞型，不同的亞型有著不同的Cas蛋白和基因排布方式，主要的亞型有： I-A、I-B、I-C、I-U、I-D、I-E、I-F、II-A、II-B、II-C、III-A、III-B、III-C、III-D、V-A、V-B、V-C、V-D、V-E、V-U、VI-A、VI-B和VI-C等。幾乎所有的CRISPR-Cas系統都能編碼Cas1和Cas2蛋白，這兩個蛋白主要是負責適應新的外源DNA/RNA并在CRISPR中插入新的Spacer。Cas1和Cas3是所有Cas蛋白中最為保守的，而其他Cas蛋白都具有很大程度的分化，這為CRISPR-Cas系統的分類帶來了很多問題。但是多樣化的Cas蛋白，也賦予了不同CRISPR-Cas系統不一樣的特點，為人們開發利用CRISPR-Cas系統提供了更多的可能性。因此，尋找新型的CRISPR-Cas系統在其開發利用過程中是至關重要的環節。