[發明專利]一種提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統、構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010934721.5
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN112080517A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 和玉兵;占華東
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/64;A01H6/46;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

1.一種提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述篩選系統為包括RUBY基因表達盒和CRISPR/Cas基因編輯系統的植物遺傳轉化載體；所述RUBY基因表達盒包括順次設置的啟動子、RUBY基因、終止子。

2.根據權利要求1所述的提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因；

所述CYP76AD1基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.1所示CYP76AD1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述DODA基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.2所示DODA氨基酸序列的核苷酸序列，

所述GT基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；優選的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根據權利要求2所述的提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之間通過DNA連接單元以任意順序連接。

4.根據權利要求3所述的提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述DNA連接單元為能夠轉錄和翻譯成一種帶有自切割功能多肽的DNA序列；

優選的，所述DNA連接單元的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.4所示2A肽氨基酸序列的核苷酸序列；

進一步優選的，所述DNA連接單元為核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2。

5.根據權利要求1所述的提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述啟動子為能在植物中發揮功能的啟動子，所述終止子為能在植物中發揮功能的終止子；

優選的，所述啟動子為能在雙子葉類植物或單子葉類植物中發揮功能的啟動子，所述終止子為能在雙子葉類植物或單子葉類植物中發揮功能的終止子；

進一步優選的，所述啟動子為能在水稻中發揮功能的啟動子，所述終止子為能在水稻中發揮功能的終止子；

更進一步優選的，所述啟動子為OsActin1的啟動子，所述終止子為tHsp。

6.根據權利要求1所述的提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統，其特征在于，所述的CRISPR/Cas基因編輯系統包括Cas蛋白表達盒、gRNA轉錄盒。

7.一種提高獲得基因編輯植株概率的篩選系統的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構建RUBY基因，將RUBY基因和終止子連接，獲得RUBY-終止子DNA片段；

2)將Cas蛋白表達盒連入植物遺傳轉化載體，構建帶有Cas蛋白表達盒的載體pCas；

3)將啟動子連入步驟2)獲得的載體pCas中，所述啟動子連接在Cas表達盒之外，構建出p啟動子-Cas載體；

4)將步驟1)獲得的RUBY-終止子DNA片段構建到p啟動子-Cas載體上，所述RUBY基因-終止子DNA片段連接在步驟3)所述啟動子下游，與啟動子構成RUBY基因表達盒，獲得pRUBY-CRISPR載體；

5)選擇目的基因靶位點，將能靶向靶位點的gRNA轉錄盒構建到pRUBY-CRISPR載體上，獲得所述篩選系統。