[發(fā)明專利]抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010932169.6
• 申請(qǐng)日: 2020-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN112142840A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊玉瑩;梁雄燕;陳雪陽;方春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C12N5/20;G01N33/574;G01N33/577
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 易賢衛(wèi)

1.一種抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：獲得分泌抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；其中，采用ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞團(tuán)，篩選獲得陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞；

S2：腹水純化及單抗鑒定：將分泌抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的腹水采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化，得到抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體，篩選鑒定，并進(jìn)行抗原表位鑒定以確定鑒定的表位在對(duì)應(yīng)的毒株中是高度保守的。

2.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述禽白血病K亞型囊膜蛋白的獲得方法包括如下步驟：

S11：將禽白血病K亞型病毒接種至雞胚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液；

S12：含有禽白血病K亞型的培養(yǎng)液離心，取上清，再進(jìn)行密度梯度離心，再取沉淀，多次重懸和離心，即得到純化的禽白血病K亞型病毒液；

S13：向純化的禽白血病K亞型病毒液中加入病毒裂解液，孵育，離心取上清，加入吸附劑，混合攪拌，離心，收集上清，超濾濃縮，得到去除病毒核蛋白的蛋白懸液；

S14：向去除病毒核蛋白的蛋白懸液中加入裂解蛋白酶溶液，攪拌下孵育過夜后，再加入裂解終止液，終止裂解，得到蛋白裂解液；

S15：將蛋白裂解液離心，取上清，超濾濃縮，即可得到純化的禽白血病K亞型囊膜蛋白液。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2步驟中的腹水純化具體包括如下步驟，

S211：向腹水中加入pH4.8、0.06mol/L醋酸鹽緩沖液，混合均勻；

S212：向S211得到的混合液中逐滴滴加正辛酸，攪拌均勻后；放于2-8℃冰箱充分沉淀；

S213：將S212步驟得到的溶液離心，取上清液，加入PBS溶液，調(diào)節(jié)pH至7.2；

S214：冰浴條件下加入飽和硫酸銨，攪拌后放于2-8℃靜置；

S215：將S212步驟得到溶液冷凍離心，取沉淀溶于PBS中，在2-8℃環(huán)境下透析；

S216：透析完畢后，冷凍離心，收集上清分裝并用Bradford蛋白定量試劑盒測定抗體濃度。

4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述S211步驟中，腹水與醋酸鹽緩沖液的體積比1:3；所述S212步驟中，腹水與正辛酸的體積比22:1；所述S213步驟中，加入PBS溶液的體積位上清液體積的1/10；所述S214步驟中，加入飽和硫酸銨至終濃度為45％。

5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2步驟中，篩選鑒定方法包括對(duì)純化后的單抗進(jìn)行第一特異性分析，具體步驟如下：

S221：將禽白血病K亞型囊膜蛋白的稀釋液、及收集誘導(dǎo)的PGEX-6p-1BL21菌的稀釋液分別在沸水中煮8～10min制成檢測抗原樣品和陰性對(duì)照樣品；

S222：將檢測抗原樣品、陰性對(duì)照樣品和預(yù)染的蛋白Maker進(jìn)行SDS-PAGE電泳，首先以80V的電壓工作約30-40min，待預(yù)染的蛋白Maker能夠明顯的看到分開的條帶后將電壓加大至120V，直至電泳結(jié)束；

S223：在加大電壓的同時(shí)，將PVDF膜浸泡至甲醇溶液中活化5min后，再將PVDF膜和轉(zhuǎn)膜使用的海綿、濾紙等浸泡在轉(zhuǎn)膜液中；

S224：電泳結(jié)束后，取下切去濃縮膠和上樣緩沖液以下的部分凝膠，安裝入轉(zhuǎn)膜所用的裝置中；

S225：轉(zhuǎn)膜時(shí)用濕轉(zhuǎn)恒定電流的方法，230mA，將樣品和Maker較好的轉(zhuǎn)印在PVDF膜；

S226：洗膜，封閉后，再次洗膜；

S227：將S226處理后的PVDF膜加入至一抗稀釋液稀釋的抗禽白血病K亞型囊膜蛋白單克隆抗體懸浮液，孵育后，取出PVDF膜沖洗后加入至稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG溶液中，孵育，取出PVDF膜，沖洗，拍照并成像。