[發(fā)明專利]一種外泌體的制備方法及含有外泌體的干細(xì)胞增殖試劑

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010918761.0
• 申請(qǐng)日: 2018-05-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112280734A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東芙金干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;G01N33/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種外泌體的制備方法及含有外泌體的干細(xì)胞增殖試劑。該外泌體的制備方法包括：步驟一：將不含外泌體血清的培養(yǎng)基加入到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，將其稀釋成細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收取培養(yǎng)后的上清液，進(jìn)行外泌體的提取；步驟二：去除所述上清液中的細(xì)胞碎片、死細(xì)胞和雜質(zhì)；去除上清液后加入磷酸緩沖鹽溶液PBS溶解收集外泌體沉淀，使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，并將所得的所述外泌體沉淀分裝于無(wú)菌離心管中，保存?zhèn)溆?。該方法通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明早代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性及相關(guān)功能，是潛在改善大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞功能的有效策略。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明實(shí)施例涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種外泌體的制備方法及含有外泌體的干細(xì)胞增殖試劑。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSCs)是一類具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后可以分化為多種組織和細(xì)胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反應(yīng)，是再生醫(yī)學(xué)中一種較為理想的種子細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs)作為一種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有更強(qiáng)的分化潛能和增殖能力。值得注意的是，大量傳代培養(yǎng)以后，有些細(xì)胞仍能保持其多潛能性，而有些細(xì)胞則向特定的方向分化或者開(kāi)始衰老，即生長(zhǎng)速度逐漸變慢，細(xì)胞形態(tài)也由長(zhǎng)梭形變的扁平粗大，進(jìn)而失去臨床上的使用價(jià)值，使用于細(xì)胞治療的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量非常有限。因此，申請(qǐng)人設(shè)想，采用一種細(xì)胞分泌的成分作為添加物，維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增值和存活，便于維持其功能的正常發(fā)揮。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室中通常在培養(yǎng)基中添加胎牛血清(FBS)來(lái)促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是該方法增加了收獲細(xì)胞攜帶病原體、異種抗原的可能性，并常常導(dǎo)致各批細(xì)胞間不穩(wěn)定因素產(chǎn)生。美國(guó)FDA命令禁止將FBS培養(yǎng)的細(xì)胞用于細(xì)胞治療。因此，尋找新的可應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療的UC-MSCs培養(yǎng)基添加物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

外泌體是一種直徑為30-100nm的納米級(jí)脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞類型都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。外泌體可以保護(hù)多種生物活性物質(zhì)在細(xì)胞外環(huán)境中不被降解和稀釋，并且可以促進(jìn)這些物質(zhì)通過(guò)組織液或血液的遠(yuǎn)距離輸送，同時(shí)外泌體膜上特異性的表面配體允許它與受體細(xì)胞高效率結(jié)合，將生物分子傳遞給靶細(xì)胞。外泌體作為干細(xì)胞分泌物中的重要成分之前也有相關(guān)報(bào)道，但目前還沒(méi)有將其用于維持大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種外泌體的制備方法及含有外泌體的干細(xì)胞增殖試劑，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明早代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性及相關(guān)功能，是潛在改善大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞功能的有效策略。

第一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種外泌體的制備方法，包括：

步驟一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清的制備：將不含外泌體血清的培養(yǎng)基加入到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，將其稀釋成細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收取培養(yǎng)后的上清液，進(jìn)行外泌體的提取；

步驟二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離存化：去除所述上清液中的細(xì)胞碎片、死細(xì)胞和雜質(zhì)；去除上清液后加入磷酸緩沖鹽溶液PBS溶解收集外泌體沉淀，使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，并將所得的所述外泌體沉淀分裝于無(wú)菌離心管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步地，所述步驟一，具體包括：

采用2-4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將10mL不含外泌體血清的培養(yǎng)基加入到所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，將其稀釋成1×10⁶濃度的細(xì)胞懸液接種于25cm³的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO₂、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-72h時(shí)收取細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液，收集達(dá)到200ml以上，進(jìn)行外泌體的提取。

進(jìn)一步地，所述步驟二，具體包括：