[發明專利]一種外泌體的制備方法及含有外泌體的干細胞增殖試劑

在審

• 申請號: 202010918761.0
• 申請日: 2018-05-17
• 公開（公告）號: CN112280734A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 廣東芙金干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種外泌體的制備方法，其特征在于，包括：

步驟一、骨髓間充質干細胞上清的制備：將不含外泌體血清的培養基加入到骨髓間充質干細胞中，將其稀釋成細胞懸液接種于細胞培養瓶中培養，收取培養后的上清液，進行外泌體的提取；

步驟二、骨髓間充質干細胞外泌體的分離存化：去除所述上清液中的細胞碎片、死細胞和雜質；去除上清液后加入磷酸緩沖鹽溶液PBS溶解收集外泌體沉淀，使用無菌濾膜過濾，并將所得的所述外泌體沉淀分裝于無菌離心管中，保存備用。

2.根據權利要求1所述的外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟一，具體包括：

采用2-4代骨髓間充質干細胞，將10mL不含外泌體血清的培養基加入到所述骨髓間充質干細胞中，將其稀釋成1×10⁶濃度的細胞懸液接種于25cm³的細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO₂、濕度飽和的培養箱中培養36-72h時收取細胞培養后的上清液，收集達到200ml以上，進行外泌體的提取。

3.根據權利要求1所述的外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟二，具體包括：

將上清液于4℃、400×g，離心10min，轉移上清、除去細胞碎片；4℃、2000×g，離心10min，轉移上清、除去死細胞；使用0.22μm的無菌濾膜過濾上清液，去除雜質；4℃ 120000×g、超速離心150min沉淀外泌體，去除上清液后加入400μl PBS溶解收集外泌體沉淀，最后再使用0.22μm的無菌濾膜過濾，并將所得的所述外泌體沉淀分裝于無菌離心管中，-80℃保存備用。

4.根據權利要求1-3中任意一項所述的外泌體的制備方法，其特征在于，在步驟二后，所述方法還包括：

步驟三、通過western blot方法檢測所述骨髓間充質干細胞來源的外泌體標志蛋白CD9和CD81的表達情況，對所述外泌體進行鑒定。

5.根據權利要求4所述的外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟三，具體包括：

用BCA蛋白定量試劑盒測定外泌體蛋白質濃度，并按照30μg的上樣量，用PBS補足到32μl，加入8μl的5×SDS 上樣緩沖液混合均勻，煮沸5min；制備濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE分離膠及5%的濃縮膠；按穩壓200V進行濃縮膠和分離膠的電泳；半干轉膜法恒壓15V轉膜1h；取出膜后，用1×PBS’T洗膜5min后加入封閉液，室溫緩慢搖動2h（或4℃過夜）；棄去封閉液，用PBS’T洗膜3次，5min/次；加入合適比例稀釋的兔抗人CD9、兔抗人CD81的一抗溶液，于4℃過夜孵育；棄去一抗溶液，用PBS’T洗膜3次，5min/次，之后加入合適比例稀釋的HRP標記的羊抗兔的二抗溶液，室溫緩慢搖動2h；棄去二抗溶液，用PBS’T洗膜3次，5min/次；ECL顯色，并在發光凝膠成像系統上曝光檢測。

6.一種含有外泌體的干細胞增殖試劑，其特征在于，包括利用如權利要求1-4中任意一項所述方法制備的外泌體，以及用于培養人臍帶間充質干細胞的基礎培養基。

7.根據權利要求6所述的含有外泌體的干細胞增殖試劑，其特征在于，所述外泌體在所述基礎培養基中的終濃度為20μg/ml。

8.根據權利要求6或7所述的含有外泌體的干細胞增殖試劑，其特征在于，所述含有外泌體的干細胞增殖試劑用于培養人臍帶間充質干細胞。

9.根據權利要求6或7所述的含有外泌體的干細胞增殖試劑，其特征在于，所述外泌體是由第2-4代的骨髓間充質干細胞分泌的。

10.根據權利要求6或7所述的含有外泌體的干細胞增殖試劑，其特征在于，所述人臍帶間充質干細胞為9-12代的人臍帶間充質干細胞。