[發(fā)明專利]食品中銅鋅-超氧化物歧化酶酶活的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010918563.4
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN111979294B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發(fā)明（設計）人: 黃福偉;黃健翔;唐保國
• 申請（專利權(quán)）人: 上海凈暢檢測科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 上海遠同律師事務所 31307
• 代理人: 劉必榕

本發(fā)明公開了一種食品中銅鋅?超氧化物歧化酶酶活的檢測方法，其包括以下步驟：制備待檢測樣品提取液，并分為等量的第一份樣品提取液和第二份樣品提取液；以鄰苯三酚自氧化法測定第一份樣品提取液的酶活為U1；在第二份樣品提取液中加入酶滅活劑，酶滅活劑為酶抑制劑和氨基酸的混合物，用鄰苯三酚自氧化法測定第二份樣品提取液的偽酶活U2；計算待檢測樣品提取液酶活實際值U＝U1?U2。本發(fā)明綜合采用酶抑制劑結(jié)合氨基酸的處理手段，能有效檢測出樣品中真實的SOD酶活性，而且操作簡單、成本低、易于在基層檢測機構(gòu)推廣應用。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種食品中銅鋅-超氧化物歧化酶酶活的檢測方法。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(SOD)是一種催化超氧陰離子自由基(O^2-)通過歧化反應轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶類，它的作用是降低超氧化物對生命體的毒害作用，使處于氧環(huán)境下的所有生命細胞具有一種抗氧化防御機制，它的活性的高低代表了生物應對脅迫的能力。SOD分布極為廣泛，迄今已從細菌、真菌、藻類、植物、原生動物、昆蟲、魚類和哺乳動物等各種生物體內(nèi)分離到。當生物受到外界生理或非生理因素脅迫而產(chǎn)生過量的活性氧時，超氧化物歧化酶就可以清除這些氧自由基，從而防止氧自由基破壞細胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護細胞免受氧化損傷。SOD是生物體內(nèi)最重要的且最佳的自由基清除劑，已被充分證明了其在防治與超氧自由基有關疾病方面的有效作用，例如延緩人體衰老、預防疾病、改善人體免疫力，并已在食品及化妝品中有應用。

Cu/Zn-SOD是分布最為廣泛而且研究最深入的一種SOD。大多數(shù)原始的無脊椎動物細胞中都存在Cu/Zn-SOD，脊椎動物則一般含有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，人、鼠、豬、牛等紅細胞和肝細胞中含Cu/Zn-SOD，其主要存在于細胞質(zhì)，同時也存在于線粒體內(nèi)外膜之間，真菌里一般含Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。Cu/Zn-SOD的活性中心包括一個Cu離子和一個Zn離子。研究表明，Cu的存在是Cu/Zn-SOD活性所必需的，它直接與超氧陰離子自由基作用。Zn周圍環(huán)境擁擠，不直接與超氧陰離子自由基作用，它起到穩(wěn)定活性中心周圍環(huán)境的作用。二價銅離子與其周圍四個組氨酸上的氮原子以配位鍵結(jié)合，構(gòu)型是一個畸變的近平面四方形。Zn的周圍有三個組氨酸通過氮原子與之配位，其中一個組氨酸被Cu和Zn所共用，形成咪唑橋結(jié)構(gòu)。另外，Zn還同一個天冬氨酸殘基配位，使Zn形成畸面四面體配位構(gòu)型。

目前，超氧化物歧化酶活性的主要測定方法有直接法、鄰苯三酚自氧化法、細胞色素C還原法、化學發(fā)光法、熒光動力學法、免疫學方法、簡易凝膠過濾擴散法、極譜氧電極法、微量測活方法等。

1.直接法是根據(jù)O^2-或產(chǎn)生O^2-的物質(zhì)本身的性質(zhì)測定O^2-的歧化量，從而確定SOD的活性。經(jīng)典的直接法包括：脈沖輻射分解法、電子順磁共振波法(EPR)、核磁共振法。由于所需的儀器設備價格昂貴，一般較少應用。

2.鄰苯三酚自氧化法是基于經(jīng)典的分光光度法，在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，測定波長為325nm、420nm或650nm，同時產(chǎn)生O^2-，SOD催化O^2-發(fā)生歧化反應從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量。該法具有特異性強，所需樣本量少，操作快速簡單，重復性好，靈敏度高，試劑簡單等優(yōu)點。

3.細胞色素C還原法是黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O^2-使一定量的氧化型細胞色素C還原為還原型細胞色素C，后者在550nm有最大吸收。在SOD存在時，由于一部分O^2-被SOD催化而歧化，O^2-還原細胞色素C的反應速度則相應減少，即其反應受到抑制。將抑制反應的百分數(shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此計算樣品中SOD活性，但該法靈敏度較低。