[發明專利]一種修飾的乙酰膽堿酯酶Ache基因及其應用

在審

• 申請號: 202010914500.1
• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號: CN111979256A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 喬想金;白麗娟;郭潤芝;李文新;王曉旋;薄瑞;孫尚琛
• 申請（專利權）人: 蘭州蘭石能源裝備工程研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/81;C12N9/18
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 曹向東

本發明涉及一種修飾的乙酰膽堿酯酶Ache基因，該基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。本發明還公開了該基因在制備重組乙酰膽堿酯酶方法的應用。本發明利用基因工程手段，將家蠅Ache基因編碼區插入到酵母表達載體中，并轉化畢赤酵母表達菌株，篩選出了高表達的基因工程菌株，用甲醇進行誘導后實現了Ache蛋白在畢赤酵母中的過量表達，從而為工業發酵生產乙酰膽堿酯酶提供了高效方法。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種修飾的乙酰膽堿酯酶Ache基因及其應用。

背景技術

我國是農業生產大國，同時也是世界上農藥使用量最大的國家。據統計，我國平均每年生產化學農藥約100萬噸，僅次于美國居世界第二。我國又是農藥使用大國，平均每年防治面積為49億畝次。然而，由于農藥濫用及監管的不到位，農副產品中農藥殘留問題普遍存在，嚴重影響了人類身體健康，直接降低了我國食品安全水平和大宗農產品出口的國際競爭力。由于病蟲害耐藥性的產生，農藥的品種和用量也與日俱增，這對土壤、大氣和水體的污染、對環境質量影響與破壞是嚴重的。

農藥殘留已成為環境和食品污染的主要原因之一，特別是有機磷和氨基甲酸酯類農藥對人類具有高毒性。有機磷、氨基甲酸酯類農藥因具有防治譜廣、價格低廉、種類多等特點而被廣泛用于各種農作物的生產。這兩類農藥殘留的危害主要有以下幾點：

①危害人體健康。有機磷、氨基甲酸酯類農藥具有致畸性、致癌性、致突變性，對人類和其它哺乳動物危害大，可以降低免疫能力并誘發腫瘤，對胎兒的發育有明顯的抑制作用，損害神經系統等。近年來，有機磷、氨基甲酸酯類農藥導致男性不育率明顯增加。

②嚴重污染環境。對環境的污染途徑主要是田間施用，有機磷、氨基甲酸酯類農藥施到田間，只有1%~2%的農藥作用于病蟲害，10%~20%的農藥附著在農作物表面，其余部分進入環境，對土壤、水體和空氣造成污染。其次，未使用農藥和農藥包裝物的隨意丟棄、農藥工廠意外泄露和廢水排放都會造成周圍環境的污染。

③影響出口經濟貿易。農藥殘留是很多國家設置貿易“綠色壁壘”的重要手段。由于我國農產品有機磷農藥殘留超標，我國農產品出口嚴重受阻。近幾年歐盟對我國茶葉中農藥殘留的規定項目不斷增多，有機磷類農藥已被許多國家列為最先接受登記和殘留限量再評價的一類農藥，這些規定嚴重阻礙了我國農產品的出口貿易。

④破壞生態平衡。有機磷和氨基甲酸酯類農藥的大量施用，破壞了天敵與害蟲之間的生態平衡，其導致害蟲耐藥性不斷增加及天敵數量下降。農藥殘留導致土壤中生物多樣性降低，使生產能力下降。農藥進入水體后會在水生生物體內富集，嚴重時會引起生物大面積死亡。

目前，有機磷、氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測主要分為儀器分析法和生物法兩大類。這兩類方法對設備及相應操作要求極高、檢測過程復雜、周期長、成本高、不能及時顯示結果，難以普及至日常民用。而且，食品中很多是鮮活農產品，這就需要一種更快、更精準的快速的農藥殘留篩查方法。

國外利用酶抑制法快速檢測農產品中農藥殘留，其原理是基于有機磷、氨基甲酸酯類農藥可特異性地抑制昆蟲中樞神經系統中乙酰膽堿酯酶的活性而使昆蟲中毒致死。因此，可以通過農藥對乙酰膽堿酯酶活性的抑制來檢測農藥的殘留情況，一般是通過抑制率判斷樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農藥的存在及其含量的多少。酶抑制法能在10 min~30min內快速測定蔬菜中有機磷、氨基甲酸酯類農藥殘留，現已成為國內外快速檢測農藥殘留的主流技術。因此，提高乙酰膽堿酯酶表達效率對酶抑制法檢測農殘有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種修飾的乙酰膽堿酯酶Ache基因。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供該修飾的乙酰膽堿酯酶Ache基因的應用。