[發明專利]一種高親和力增強綠色熒光蛋白納米抗體及其編碼基因的篩選方法

有效

• 申請號: 202010912569.0
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN112010969B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 付金衡;劉貝;黃云祥;鐘引鳳;周方月;王丹
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 袁紅梅

本發明屬于基因工程領域，具體為公開了高親和力增強綠色熒光蛋白納米抗體及其編碼基因的篩選方法。所述抗體是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。還公開了一種宿主細胞，可以表達抗EGFP納米抗體，具有高水溶性、高耐性、高穩定性，高抗原結合性、低免疫原性以及高表達性。本發明提供的抗EGFP納米抗體可特異性的結合綠色熒光蛋白，且其有較高親和力，可應用與EGFP的基礎研究中。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種高親和力增強綠色熒光蛋白納米抗體及其編碼基因的篩選方法。

背景技術

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein GFP)是Shimomure等于1962年首次從維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria)中分離出的蛋白，可自發產生熒光，發色基團位于β桶和α-螺旋形成的致密結構域中，其性質穩定，被廣泛應用于抗體檢測、細胞內定位、單分子熒光成像等。EGFP(enhanced green fluorescent protein),即增強綠色熒光蛋白,是經過改造后的定點突變體增強型GFP，其熒光強度更強，更易于檢測，常作為在報告基因來研究基因表達調控，探索信號通路以及示蹤成像等，EGFP作為生命科學研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究與應用價值。使得針對EGFP的高親和力特異性抗體在基礎生物研究十分重要。

納米抗體是一種天然缺失輕鏈的功能性抗體(即重鏈抗體)，能與特異性的抗原結合。這種抗體的可變區域僅僅由一條鏈組成，因此又稱為單域重鏈抗體，體積很小，分子大小僅為15kDa。具有免疫原性低、穩定性高、可溶性好；可以使用多種不同的表達系統如細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞甚至植物宿主細胞等進行表達。這些優良的特性使得納米抗體在基礎研究領域具有極大的應用價值。

EGFP單克隆或多克隆抗體是通過免疫動物獲得的，但其相對分子質量較大、生產成本高、穩定性差等問題，其應用受到限制。由于納米抗體能在微生物中穩定高效表達，可以克服這些問題，因此開發高親和力的抗EGFP納米抗體及其原核表達載體和菌株，在對以EGFP為標簽的蛋白研究中將有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供針對EGFP的高親和力納米抗體，以及該納米抗體的原核表達載體和菌株。本發明表達純化了該納米抗體并證明了納米抗體親和力高且能夠特異結合EGFP，可應用于EGFP基礎研究。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

本發明提供了一種高親和力增強綠色熒光蛋白納米抗體，其特征在于，所述納米抗體的可變區具有3個互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，其中所述納米抗體的可變區序列由SEQID NO.1所述氨基酸序列組成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明還提供了一種高親和力增強綠色熒光蛋白納米抗體的編碼基因的篩選方法，包括以下步驟：

(1)用綠色熒光蛋白免疫羊駝，第4次免疫后抽取羊駝外周血，分離血細胞提取血細胞總RNA，反轉錄成cDNA后，通過PCR擴增得到VHH編碼基因；

(2)將VHH編碼基因克隆到噬菌體展示載體上，構建VHH噬菌體展示文庫；

(3)將綠色熒光蛋白包被于酶標板中，通過噬菌體展示技術從文庫中富集綠色熒光蛋白納米抗體；

(4)通過ELISA方法篩選陽性單克隆；

(5)陽性單克隆菌落送測序，獲得綠色熒光蛋白納米抗體基因序列。

進一步地，所述載體為pComb3XSS。

本發明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體，細胞可選擇大腸桿菌BL21(DE3)，易于培養，周期短，操作方便，且菌株能夠穩定擴增。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：