[發明專利]一種制備屈昔多巴的方法和應用

有效

• 申請號: 202010886780.X
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112011580B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 胡虎;陳海濱;劉思彤;黃盈琪;陳軍;金爐萍;王吉勇;彭沁利;黃勇開
• 申請（專利權）人: 寧波酶賽生物工程有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C07C229/36;A61K31/198;A61P25/16;A61P9/02
• 代理公司: 北京棘龍知識產權代理有限公司 11740
• 代理人: 李改平

本發明涉及生物技術領域，具體公開了一種制備屈昔多巴的方法和應用，所述制備屈昔多巴的方法是利用醛縮酶進行不對稱縮合，以3,4?二羥基苯甲醛及甘氨酸為底物，通過醛縮酶催化，僅需一步反應即可合成所需要的產物，所用的醛縮酶催化活性及手性選擇性高，無需手性化學拆分，理論上原子利用率為100%，反應過程簡單，綠色環保，原子經濟性極高，克服了化學法合成屈昔多巴的缺陷，是一種極具競爭力的屈昔多巴制備方法，解決了現有制備屈昔多巴的方法大多存在工藝操作復雜且環境污染大的問題。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種制備屈昔多巴的方法和應用。

背景技術

屈昔多巴(Droxidopa)，也叫屈西多巴，化學名稱是(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羥基苯基)-3-羥基丙酸，它是一種白至灰白色結晶或結晶粉的化學品，通常為抗帕金森癥藥，臨床上主要用于改善由帕金森病引起的步態僵直和直立性頭暈。

目前，屈昔多巴的制備方法通常是通過化學拆分法進行制備，例如，以3,4-二羥基苯甲醛為起始原料，經芐基保護制得3,4-二芐氧基苯甲醛，并與甘氨酸縮合生成外消的蘇赤式-3-(3,4-二芐氧基苯基)絲氨酸，經手性拆分及催化加氫制得屈昔多巴，該方法理論收率只能達到50％，原子經濟性差，而且所用試劑多，步驟繁瑣，環境污染大，是一種非常不經濟環保的方式。為了提高環保性，部分人是通過芐氯保護羥基得到的3,4-二芐氧基苯甲醛為底物，以醛縮酶為催化劑進行不對稱縮合，并通過后續的手性拆分及鈀碳加氫等操作獲得屈昔多巴，該方法相較于傳統的化學合成法有較大優勢，但仍然存在酶手性選擇性不佳的問題，并且該方法仍然存在較多步驟的化學反應，在經濟性、環保等方面仍有提高的空間。因此，上述的技術方案在實際操作時存在以下不足：現有制備屈昔多巴的方法大多存在工藝操作復雜且環境污染大的問題。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種制備屈昔多巴的方法，以解決上述背景技術中提出的現有制備屈昔多巴的方法大多存在工藝操作復雜且環境污染大的問題。

為實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種制備屈昔多巴的方法，包括以下步驟：

以3,4-二羥基苯甲醛及甘氨酸為底物，以PLP(Pyridoxal5-phosphatemonohydrate，磷酸吡哆醛)為輔酶，以醛縮酶為催化劑，并共同置于緩沖液中構成反應體系進行酶催化反應，分離，得到所述的屈昔多巴。

作為本發明進一步的方案：所述醛縮酶是由醛縮酶基因編碼的酶，其中，所述醛縮酶基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示，所述醛縮酶的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。

作為本發明再進一步的方案：在所述制備屈昔多巴的方法中，所述醛縮酶基因的核苷酸序列與氨基酸序列也可以參考使用中國專利(專利公開號CN110869383A)工程化多肽及其在合成β-羥基-α-氨基酸中的應用中的工程化多肽。

作為本發明再進一步的方案：在所述制備屈昔多巴的方法中，各原料在所述反應體系中的濃度分別為：醛縮酶0.5-200g/L，磷酸吡哆醛0.01-0.5mmol/L，3,4-二羥基苯甲醛10-200g/L，甘氨酸5-40mol/L。

作為本發明再進一步的方案：在所述制備屈昔多巴的方法中，各原料在所述反應體系中的濃度分別為：醛縮酶1-20g/L，磷酸吡哆醛0.2-0.4mmol/L，3,4-二羥基苯甲醛10-40g/L，甘氨酸5-20mol/L。

作為本發明再進一步的方案：優選的，所述的醛縮酶為購自寧波酶賽生物工程有限公司的產品，其是通過在大腸桿菌重組表達出來的蛋白，為大腸桿菌表達產物，表達基因是醛縮酶基因，宿主細胞為E.Coli,BL21(DE3)。對應的，所述醛縮酶可以是表達所述醛縮酶的大腸桿菌噬菌體、細胞破碎上清或酶粉，即為大腸桿菌表達產物所對應的大腸桿菌濕菌體、細胞破碎上清或酶粉，具體根據需要進行選擇，這里并不作限定。