[發明專利]一種N-DMV實時熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202010884335.X
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961759A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 萬春和;黃瑜;程龍飛;傅光華;陳紅梅;施少華;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明涉及一種N?DMV實時熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒，屬于動物傳染病學領域。本發明包括特異性引物和探針序列的設計、標準質粒的構建、實時熒光定量PCR擴增方法的建立和優化、結果檢測判定。本發明利用所述引物和探針建立的檢測N?DMV的實時熒光定量PCR方法，在檢測N?DMV上靈敏度高、穩定性好、特異性強、重復性好，最低可檢測63.17個拷貝，可用于檢測臨床樣本中N?DMV的感染檢測。

技術領域

本發明涉及一種N-DMV實時熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。熒光探針法是用序列特異的熒光標記探針來檢測產物，探針法的出現使得定量PCR技術的特異性比常規PCR技術大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標（molecular Beacon）。TaqMan探針法是指實時熒光定量PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如Eclipse、TAMRA、BHQ1等。當探針完整的時候，5′端報告基團經儀器光源激發的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發的熒光信號(就是說5’熒光基團的發射波長正好是3’ 熒光基團的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3’熒光基團而發出其它熒光)。隨著實時熒光定量PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會切割探針，釋放5′端報告基團游離于反應體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。

微核糖核酸科（Picornaviridae）病毒是一類呈球形、無囊膜的單股正鏈RNA病毒，其病毒顆粒直徑約20-30nm。前期基因組學研究發現微核糖核酸科病毒長度一般為6.6kb～9.8kb。典型的微核糖核酸科病毒的基因組一般僅含有一個大的開放閱讀框（open readingframe，ORF），其兩側分別是5’-UTR和3’-UTR。目前，已見有火雞源、雞源、鴿源和鴨源微核糖核酸科Megrivirus屬（中文名暫未確定）成員被發現。對新型鴨源Megri病毒（novel duckmegrivirus, N-DMV）（Liao Q，等. Genomic characterization of a novelpicornavirus in Pekin ducks. 2014，172(1-2):78-91. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.05.002.）基因組分析發現N-DMV具有類似于Megrivirus屬病毒的基因組結構，其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序，但亦有自身的特點。不計poly(A)尾，N-DMV基因組長度為9700bp，是微病毒科中最長的。最顯著的特點位于2A區，該區由兩個功能未知的蛋白（2A1、2A2）和以及一個parachovirus樣2A3組成。研究還發現，N-DMV具有和火雞源、雞源、鴿源Megri病毒相似的基因組結構特征，且在遺傳進化上處于同一大的遺傳進化分支。

當前國內外尚未見實時熒光定量PCR檢測N-DMV的引物、探針及其試劑盒相關研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

發明內容