[發明專利]外泌體在細胞外基質中的富集方法、富含外泌體的ECM生物材料與應用

有效

• 申請號: 202010878116.0
• 申請日: 2020-08-27
• 公開（公告）號: CN111961681B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 索廣力;于延珍;喬勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12N5/0797;C12N5/0775;C12N5/071;C12N5/073;A61K48/00;A61K35/12;A61K47/46;A61K31/7105
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

本發明公開了一種外泌體在細胞外基質中的富集方法、富含外泌體的ECM生物材料與應用。本發明還公開了一種CBD?LAMP 2b融合基因。含有前述CBD?LAMP 2b融合基因的細胞系能夠穩定表達CBD?LAMP 2b蛋白，并能夠穩定分泌結合到細胞外基質上的外泌體，實現外泌體在細胞外基質中的富集。所述ECM生物材料由前述細胞系合成并分泌到胞外。本發明構建了攜帶有膠原結合區域CBD的LAMP 2b融合蛋白，進而使外泌體具有結合到ECM成分之一膠原I上的能力，ECM生物海綿實現了對于外泌體的抓取和富集，并且采用反復凍融的方式制備富含外泌體的ECM生物材料，其可以作為藥物或miRNA載體，實現對于疾病的藥物遞送。

技術領域

本發明涉及一種外泌體在細胞外基質中的富集方法，具體涉及一種利用膠原結合域多肽（Collagen Binding Domain, CBD）實現外泌體在細胞外基質中富集的技術方法，以及制備富含大量外泌體的細胞外基質生物材料及其應用，屬于生物材料及基因工程技術領域。

背景技術

外泌體（exosome）是由多囊泡體與細胞膜融合形成的直徑為50-200 nm的細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）（Gurunathan S, Kang M, Jeyaraj M, et al.Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, andMultifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.[J]. Cells, 2019, 8(4).），在蔗糖梯度中浮力密度為1.13-1.18 g/ml，在電鏡下為具有膜結構的杯形。1983年，外泌體首次在網織紅細胞中被發現，隨后Rose Johnstone將這類EVs命名為“外泌體”（Harding C V,Heuser J E, Stahl P D, et al. Exosomes: Looking back three decades and intothe future[J]. Journal of Cell Biology, 2013, 200(4): 367-371.）。很長時間外泌體都充當著默默無聞的信息傳遞者，剛被發現時更是被當成細胞代謝所產生的“排泄物”。但隨著外泌體研究的深入，科學家發現外泌體中包含各種生物活性物質，例如：細胞因子、mRNA、miRNA等。這些生物活性物質參與細胞增殖和凋亡、炎癥反應、血管生成、纖維化、組織修復等重要生理過程（Gupta K, Goldufsky J W, Wood S, et al. Apoptosis andCompensatory Proliferation Signaling Are Coupled by CrkI-ContainingMicrovesicles[J]. Developmental Cell, 2017, 41(6).；G V N, Dangelo G, RaposoG, et al. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19(4): 213-228.；ImmunomodulatoryEffects of Mesenchymal Stromal Cells-Derived Exosome.）。目前外泌體收集分離方式主要有五種：①超速離心法；②密度梯度離心法；③共沉淀法；④凝膠組排層析法；⑤場流分級法。在實驗研究中外泌體的提取普遍采用超速離心法，并且為了滿足用藥劑量，需要大規模收集細胞培養上清，這就造成了收集過程復雜和成本較高的問題。因此，如何對外泌體進行簡便快速富集成為了一個難題（Shao H, Im H, Castro C M, et al. NewTechnologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J]. Chemical Reviews,2018, 118(4): 1917-1950.）。