[發明專利]一種地衣芽孢桿菌宿主細胞及其遺傳改造方法與應用

有效

• 申請號: 202010858709.0
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN112239743B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 路福平;孫宴清;周翠霞;張會圖;李玉;劉逸寒
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/56;C12N15/54;C12N15/52;C12N9/56;C12R1/10
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于基因工程領域，具體涉及通過對地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)2709進行遺傳改造獲得的新型宿主細胞及其改造方法與應用。所述菌株是在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)2709的基礎上，通過敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并刪除9個基因組島以實現宿主細胞的基因組精簡來構建的。經過基因改造獲得的宿主細胞有效改進了發酵生產性能及發酵過程控制。以AprE的生產為例，eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC基因，和9個基因組島敲除菌GR15對AprE的發酵液酶活力可高達32494±1013U/mL，高產酶時期長達16h，較對照菌提高了36％。

技術領域：

本發明屬于基因工程領域，具體涉及通過對地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)2709進行遺傳改造獲得的新型宿主細胞及其改造方法與應用。

背景技術：

B.licheniformis 2709工業微生物，來源于土壤等自然環境，進化過程中形成一系列未經馴化的不良特性，包括：1)發酵過程中易形成泡沫，導致極高的發酵污染風險；2)營養缺陷時易形成芽孢，影響目標產物的進一步積累并增加發酵設備的消殺成本；3)形成大量粘性物質，阻礙菌體生長和產物合成，在大規模化工業生產中增加攪拌與溶氧的需求；4)分泌合成大量的胞外蛋白等，這無疑嚴重影響目標產物的合成與積累，增加了工業化操作的要求與難度，不利于工業化生產的整體效益。

近年來，為獲得性能優良的工業微生物細胞工廠，學者們在生產菌株的遺傳改良方面開展了深入的研究。Zhang等人通過敲除影響泡沫形成的脂肽編碼基因srfA，優化了未經馴化的野生菌株B.subtilis ATCC 6051a的生產性能；Illing等人通過刪除芽孢形成關鍵控制基因sigE提高了酶的合成能力；模式菌B.subtilis WB₈₀₀屬于多重蛋白酶缺陷型菌株，這明顯促進其它胞外分泌蛋白的積累。

此外，B.licheniformis理論上可以從基因組精簡中獲益更多，因為它能夠合成大量的對細胞生命活動非必需的次級代謝產物。因此，從分子水平對工業微生物宿主進行分子改良，對微生物細胞生產性能的提升具有重要意義。

基因組精簡工程主要在原核細胞中進行，尤其是E.coli和B.subtilis等模式菌株，并取得了一定的成果，未見針對工業菌株B.licheniformis 2709基因組精簡的報道。分析宿主的基因組發現，存在大量的孤島基因、冗余基因、假基因等非必需基因，以及控制次級代謝產物合成的基因，這大大增加了細胞代謝負擔和能耗，導致營養資源浪費，進而影響細胞的生長與發酵性能。因此，通過小基因組技術實現在特定培養基中底盤細胞的構建，是可行且有價值的。

目前，基因組精簡工程主要在原核細胞中進行，未見針對工業菌株B.licheniformis 2709基因組精簡的報道。分析宿主的基因組發現，存在大量的孤島基因、冗余基因、假基因等非必需基因，以及控制次級代謝產物合成的基因，這大大增加了細胞代謝負擔和能耗，導致營養資源浪費，進而影響細胞的生長與發酵性能。

本發明通過分析鑒定影響宿主發酵生產的不良性能，確定相關控制基因，采用建立的遺傳操作系統高效刪除相關編碼基因，以消除宿主細胞不良的生產特征，提升其發酵生產性能；并結合宿主細胞的基因組信息，分析確定可能的孤島基因等非必需基因，采用小基因組技術，實現有效的基因組精簡，為構建適用于工業化生產酶制劑的底盤細胞奠定基礎。

發明內容：

為了實現上述目的，本發明將提供一株適用于工業化生產的地衣芽孢桿菌宿主菌，所述菌株是在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)2709的基礎上，通過敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并刪除9個基因組島以實現宿主細胞的基因組精簡來構建的；