[發(fā)明專利]穩(wěn)定表達(dá)hFcRn細(xì)胞株的制備方法及其在藥物篩選中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010822793.0
• 申請(qǐng)日: 2020-08-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112048476A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓照中;潘紅芽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 領(lǐng)諾（上海）醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N15/65;C12Q1/02;G01N33/68;C12R1/91
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本發(fā)明公開(kāi)了一種FcRn穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系及其在藥物篩選中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了該細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用實(shí)例，包括(1)將FcRn基因插入真核表達(dá)載體；（2）將步驟1得到的載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)加壓篩選得到穩(wěn)定表達(dá)FcRn的細(xì)胞系；3）步驟2得到的細(xì)胞系用于藥物篩選。本發(fā)明的獨(dú)特之處在于1）實(shí)現(xiàn)了FcRn和β2M蛋白的同比例共表達(dá)，便于組裝有功能活性的FcRn異源二聚體；2）選用有極性特征的細(xì)胞比如MDCK細(xì)胞作為FcRn表達(dá)的宿主細(xì)胞，便于做FcRn介導(dǎo)的抗體或其它藥物分子內(nèi)吞、外泌及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力測(cè)試；3）提供了應(yīng)用相應(yīng)的細(xì)胞株檢測(cè)、篩選以FcRn為基礎(chǔ)的藥物內(nèi)吞、外泌及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的基本方法和技術(shù)途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定表達(dá)hFcRn細(xì)胞株的制備方法及其在藥物篩選中的應(yīng)用

背景技術(shù)

hFcRn是由大小兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，分別為分子量45～53kD的α鏈和分子量14kD的β2微球蛋白(β2microglobin orβ2M)。β2微球蛋白對(duì)于hFcRn的生物學(xué)功能至關(guān)重要。晶體結(jié)構(gòu)顯示hFcRn與抗體的結(jié)合區(qū)域是CH2～CH3,在生理PH＝7.4時(shí)，抗體與FcRn解離結(jié)合，在酸性條件PH＝6.0時(shí)hFcRn與抗體結(jié)合。FcRn在體內(nèi)分布廣泛，能夠介導(dǎo)抗體或抗體類似物的內(nèi)吞、外泌和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，所以與FcRn的結(jié)合決定了IgG抗體在體內(nèi)的半衰期。Shreeram Akilesh等使用FcRn缺陷型小鼠的研究結(jié)果表明，致病性 IgG在FcRn缺陷型小鼠血液中被快速清除，因此降低了致病性IgG在FcRn缺陷型小鼠中的致病性，提示通過(guò)抑制FcRn可以用于治療由自身抗體引起的自身免疫疾病(Shreeram Akilesh等，2004，J ClinInvest. 113(9):1328-33)。同時(shí)，為了延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，也可以通過(guò)結(jié)合FcRn的方式，比如抗體或Fc融合蛋白，降低相關(guān)藥物的血清清除率并延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)半衰期，并進(jìn)而降低藥物的注射頻率。

在大鼠誘發(fā)性自體免疫重癥肌無(wú)力模型中實(shí)驗(yàn)中表明，用FcRn重鏈特異性單克隆抗體治療可以使血清中致病性IgG濃度降低，從而減輕疾病程度(Liu等，2007，J.Immunol.178：5390-5398)。在鼠關(guān)節(jié)炎模型中，高親和力FcRn抗體可以使疾病得到改善(Patel等，2011，J.Immunol.187：1015-1022)。在許多自體免疫性疾病中，高劑量施用IgG也可以緩解病情(Jin和Balthasar，2005，Hum.Immunol.66：403-410；Akilesh等， 2004，J.Clin.Invest.113：1328-1333；Li等，2005，J.Clin.Invest.115：3440-3450)。以上這些結(jié)果綜合說(shuō)明抑制FcRn能夠縮短致病性IgG的體內(nèi)半衰期，從而達(dá)到治療自身免疫疾病的目的。

在篩選、評(píng)估FcRn抑制劑或結(jié)合蛋白(包括短肽、基因工程改造的蛋白或抗體)的過(guò)程中，需要一種能夠有效模擬FcRn介導(dǎo)的內(nèi)吞、外泌和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程的體外細(xì)胞模型。本發(fā)明建立了MDCK-hFcRn細(xì)胞模型，其獨(dú)特之處在于實(shí)現(xiàn)了人源FcRn和人源β2M蛋白的同比例共表達(dá)，便于組裝有功能活性的人源FcRn 異源二聚體；選用有極性特征的細(xì)胞比如MDCK(Madin-Darby canine kidney)細(xì)胞作為hFcRn表達(dá)的宿主細(xì)胞，便于做hFcRn介導(dǎo)的抗體或其它藥物分子內(nèi)吞、外泌及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力測(cè)試。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)hFcRn細(xì)胞株的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的穩(wěn)定表達(dá)hFcRn細(xì)胞株的制備方法，具體步驟如下：

將人源FcRn和人源β2M基因克隆到真核表達(dá)載體。

該真核表達(dá)載體具有如下特點(diǎn)：