[發明專利]用于胰島培養的組合培養基及其制備方法

有效

• 申請號: 202010819023.0
• 申請日: 2020-08-14
• 公開（公告）號: CN112063577B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 張佳林;楊召銘;郭庭維;林建貞;李峰;張城碩
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京華清迪源知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發明公開了一種用于胰島培養的組合培養基及其制備方法，所述培養基包括以下原料制成：CMRL1066培養基、BSA以及羊膜提取物。本發明的新型組合培養基是將人羊膜進行液氮研磨、超聲勻漿、梯度離心、過濾除菌得到含羊膜提取物的培養基，含羊膜提取物新型組合培養基能有效保護胰島體外存活及功能。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于胰島培養的組合培養基及其制備方法。

背景技術

糖尿病是一種由于自身胰島細胞破壞導致胰島素生成不足或受體細胞對胰島素產生抵抗而使胰島素的代謝產生缺陷的葡萄糖、蛋白質及脂質代謝紊亂的綜合征，主要分為1型糖尿病和2型糖尿病。自Edmonton?Protocol發布以來，胰島移植由于其相對于成體器官移植來說創傷小、又能取得可靠的移植效果而被視為治療1型糖尿病和部分2型糖尿病的有效方法之一。

目前，在臨床胰島移植中為了胰島的進一步純化、胰島質量的檢測、胰島的運輸轉移以及受體的免疫誘導，胰島從被實驗員在供體胰腺中提取出來到被外科醫師移植到受體前需要在體外培養24-72小時，大多數移植中心采取的培養時間為48小時。在這段體外培養時間內，有超過20％的胰島丟失。研究表明，胰島在體外培養中主要的丟失原因為無血清引發的炎癥反應。目前臨床上用于體外胰島培養的培養基為CMRL1066+0.625％HSA,0.625％HSA為胰島的存活提供一定的滲透壓，但缺少血清中的各種有利于胰島細胞存活的細胞因子。

基礎研究表明CMRL1066+10％FBS更適用于體外胰島培養，但是由于動物源性而不被臨床采用。人血清中含有細胞因子，但是同時存在和胰島細胞發生免疫反應的細胞因子，容易導致胰島細胞損壞。因此，亟需研究一種新的人胰島體外培養組合培養基。

發明內容

為此，本發明提供用于胰島培養的組合培養基及其制備方法。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供一種用于胰島培養的組合培養基，所述培養基包括以下原料制成：CMRL1066培養基、BSA以及羊膜提取物。

本發明的一個實施例中，所述BSA的質量百分數為0.625％。

本發明的一個實施例中，所述羊膜提取物蛋白的質量濃度為0.1-1.0mg/mL。

本發明還提供一種制備所述的用于胰島培養的組合培養基的方法，其包括：向所述CMRL1066培養基中添加BSA和羊膜提取物，混合均勻，得到所述組合培養基。

本發明的一個實施例中，所述羊膜提取物的添加方法為：

用含青霉素和鏈霉素的PBS溶液清洗羊膜，將清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜顆粒，將所述羊膜顆粒加入到CMRL1066基礎培養基中，4℃超聲勻漿，將超聲勻漿物離心，取上清液，將所述上清液過濾后，得到濾液，再向所述濾液中添加BSA后，得到所述組合培養基。

本發明的一個實施例中，所述羊膜顆粒與所述CMRL1066培養基的質量體積比為1:2。

本發明的一個實施例中，所述超聲勻漿過程中，勻漿機轉速為10000rpm，超聲勻漿溫度為4℃，超聲勻漿時間為1h。

本發明的一個實施例中，所述離心為梯度離心，先4000g離心10min后，提取上清液，將所述上清液再15000g離心5min后，再提取上清液，離心溫度為4℃。

本發明的一個實施例中，所述青霉素的濃度為1000IU/ml，所述鏈霉素的濃度為0.1mg/ml。