[發明專利]一種SARS-CoV-2病毒核酸檢測的引物組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202010813271.4
• 申請日: 2020-08-13
• 公開（公告）號: CN112029903B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 馬立新;王飛;何如怡;翟超;楊軍;劉洋;余曉;劉琳琳
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

本發明公開了一種SARS?CoV?2病毒核酸檢測的引物組、試劑盒及其應用。本發明通過設計針對SARS?CoV?2病毒的N基因和ORF1ab基因的引物組，該試劑盒包括該引物組、靶向目的基因的向導DNA、帶有熒光標記的分子信標和PfAgo酶。采用本發明提供的引物組能夠簡單快速地對新冠病毒核酸進行擴增，具有重復性好，敏感度高，特異性強的特點。

技術領域

本發明屬于生物技術應用領域，具體涉及一種SARS-CoV-2病毒核酸檢測的引物組、試劑盒及其應用。

背景技術

目前，熒光定量PCR技術是新型冠狀病毒核酸檢測的主流方法。該方法基于PCR技術，通過針對于新型冠狀病毒基因組的特異性序列設計引物對，對目的核酸片段進行特異性擴增，與此同時在擴增系統中加入相應Taqman探針，探針的兩端分別標記有熒光基團和淬滅基團。擴增反應在熒光定量PCR儀中進行，隨著熱循環的進行，結合在單鏈模板上的探針會被DNA聚合酶的外切酶活性切割，熒光基團與淬滅基團分離，解除淬滅作用，產生熒光信號，對該信號進行實時檢測，就可以判斷樣本中是否含有新型冠狀病毒。目前臨床檢測主要采用是針對多個目的序列的多重熒光檢測法，靶基因包含SARS-CoV-2基因組中3段保守基因序列：開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核殼蛋白(nucleocapsidprotein，N)基因以及包膜蛋白(envelope，E)基因等。

雖然Taqman法已經得到普及，并為本次疫情的防控提供了有力保障，但是基于熒光PCR的核酸檢測方法對于儀器和操作人員的要求都很高，特別是多通道熒光定量PCR儀價格昂貴，約為25-30萬元/臺，以目前的檢測通量，每天每臺只能檢測3批次，嚴重限制了檢測通量。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種SARS-CoV-2病毒核酸檢測的引物組、試劑盒及其應用。本發明以新型冠狀病毒核殼蛋白N基因及ORF1ab基因為檢測靶基因，反應體系包括針對N基因的引物組、針對ORF1ab基因的引物組、PfAgo酶、向導DNA和分子信標；向導DNA分子可指導PfAgo酶對靶基因(N基因和/或ORF1ab基因)進行切割，產生16nt的ssDNA，ssDNA分子與游離的PfAgo酶裝配成復合物，對與新生成的向導DNA互補的分子信標進行特異性切割，產生熒光，從而實現檢測。

為實現上述技術目的，本發明采用以下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種引物組，包括SARS-CoV-2的N基因引物對和SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物對，其中：

所述SARS-CoV-2的N基因引物對包括引物NF和引物NR；

所述引物NF為如SEQ ID NO.1所示的單鏈DNA分子，或由如SEQ ID NO.1所示的單鏈DNA分子經過一個或幾個核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且與如SEQ ID NO.1所示的單鏈DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物NR為如SEQ ID NO.2所示的單鏈DNA分子、或由如SEQ ID NO.2所示的單鏈DNA分子經過一個或幾個核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且與如SEQ ID NO.2所示的單鏈DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述SARS-CoV-2的ORF1ab基因引物對包括引物OF和引物OR；

所述引物OF為如SEQ ID NO.3所示的單鏈DNA分子、或由如SEQ ID NO.3所示的單鏈DNA分子經過一個或幾個核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且與如SEQ ID NO.3所示的單鏈DNA分子具有相同功能的DNA分子；

所述引物OR為如SEQ ID NO.4所示的單鏈DNA分子、或由如SEQ ID NO.4所示的單鏈DNA分子經過一個或幾個核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加且與如SEQ ID NO.4所示的單鏈DNA分子具有相同功能的DNA分子。