[發明專利]一種具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分離鑒定方法及應用

在審

• 申請號: 202010796773.0
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111849838A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 王玉娥;陳洪巖;馬文杰;張賀
• 申請（專利權）人: 王玉娥
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/225
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 楊光

本發明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分離鑒定方法及應用，本方法通過選擇健康安全的小豬作為供體，在制備乳酸菌液時對其糞便進行篩選鑒定，降低了糞菌中有害菌存在的潛在風險；引物通過華大基因公司合成：27f：5’?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3’，1492r：5’?GGTTACCTTGTTACGACTT?3’。PCR產物送交華大基因公司進行測序，將測序結果用BLAST與GenBank數據庫中已知的菌株進行同源性比對，發現該菌株與NCBI中GenBank的16sRNA的同源性均達99.99％。結果顯示該菌種為豬源羅伊氏乳酸菌，命名為HRB1，菌液上清液能夠與病毒直接接觸后發揮抑制作用，從而降低病毒毒力。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株分離鑒定方法及應用。

背景技術

畜禽細菌性、病毒性疾病嚴重威脅著養殖業的發展,某些人畜共患病還威脅著人類健康。乳酸菌通過自身生理活動中產生的一系列代謝產物或菌體組成成分，阻斷致病菌的定植、侵入、繁殖以及病毒吸附、穿入、生物合成、裝配和釋放中的某一環節或某幾個環節而直接抑制病毒和細菌,并通過提高機體的免疫功能,促進機體的特異性和非特異性免疫功能而間接抑制病毒和細菌。研究和開發抗畜禽細菌和病毒的乳酸菌有極廣闊的前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從糞便中制備乳酸菌液的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

所述一種具有抑菌和抗病毒能力的乳酸菌菌株，通過以下方法獲得：

步驟a：菌株的分離與純化通過分菌實驗進行；

步驟b:通過形態、生理生化和分子鑒定相結合的方法對上述保存菌種的形態特征、生理生化特征以及16sRNA基因序列進行鑒定；

所述菌株的分離與純化分菌實驗包括以下步驟：

(1)選擇健康供體，采取供體糞便；

(2)準確稱取糞便0.5g，加入4.5mL無菌生理鹽水，制備混懸液；

(3)將混懸液進行梯度稀釋，再將10^-2、10^-3、10^-4混懸液分別涂布于含1.5％CaCO₃的MRS固體培養基中，37℃條件下厭氧培養45h；

(4)待菌落長出后，挑選出明顯具有碳酸鈣溶解圈的單個菌落于MRS固體培養基上進行3次劃線純化，挑取碳酸鈣溶解圈最大的菌落于MRS肉湯培養基中培養24h并保存其菌種。

進一步的，所述乳酸菌是從豬只糞便中分離制備獲得,并且是PRRSV疫苗保護組豬只的不同時間點糞便，選取抗體水平較高、清除病毒能力強的豬只糞便進行分菌試驗。

進一步的，選取培養24h的菌液5mL，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，使用細菌16S rRNA通用引物(27f-1492r)進行基因擴增。

本發明的有益效果為：

本方法通過選擇健康安全的小豬作為供體，在制備乳酸菌液時對其糞便進行篩選鑒定，降低了糞菌中有害菌存在的潛在風險；引物通過華大基因公司合成：27f： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR產物送交華大基因公司進行測序，將測序結果用BLAST與GenBank數據庫中已知的菌株進行同源性比對，發現該菌株與NCBI GenBank中羅伊氏乳酸菌的16sRNA的同源性均達99.99％。結果顯示該菌種為豬源羅伊氏乳酸菌，命名為HRB1，菌液及其上清液能抑制致病菌繁殖，菌株上清液能夠與病毒直接接觸后發揮抑制作用，從而降低病毒毒力。