[發明專利]一種將酶固定化在納米纖維上的方法

有效

• 申請號: 202010795308.5
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111876405B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 溫朝;王冠鳳;石艷麗;李夢嬌;郭學平;劉愛華
• 申請（專利權）人: 山東華熙海御生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N11/084
• 分類號: C12N11/084;C12N11/089;C12N9/10;C12N9/20;C12N9/34;C12N9/42
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉;王維

本發明涉及一種酶固定方法，其包括如下步驟：制備包含聚砜(PSF)、聚乙烯醇(PVA)和酶的第一混合溶液：將PSF粉末溶解于溶劑中，再加入PVA粉末攪拌溶解，然后與酶溶解在水中得到的酶溶液混合；由上述第一混合溶液制備出納米纖維：將由所述第一混合溶液注入毛細管中，通過微量擠出泵擠出溶液，在高電壓作用下形成電紡絲，通過旋轉收集器收集納米纖維，并對收集的納米纖維進行真空干燥，并進行保存；進行戊二醛交聯：使用鹽酸作為催化劑，制備包含鹽酸和戊二醛的第二混合溶液，將上述制得的納米纖維放置在第二混合溶液上方的蒸汽環境中，在室溫下進行交聯；將經過交聯反應的納米纖維用蒸餾水清洗，而后添加干燥劑進行儲存。

技術領域

本申請屬于生物化工領域，具體涉及一種將酶固定化在納米纖維上的方法。

背景技術

在生物化工領域經常涉及需要將酶進行固定化的方法，以便對酶能夠重復利用以及減少反應后續的分離純化成本，其中以納米纖維作為固定化酶材料的專利文獻例如為：

中國專利文獻CN1948474A(申請號200610154566.5)公開了一種殼聚糖納米纖維復合膜固定化酶的制備方法，該方法以殼聚糖和聚乙烯醇溶于冰醋酸和水的混合溶劑中形成透明溶液，通過靜電紡絲法制成殼聚糖納米纖維復合膜，并以其作為酶固定化的載體，通過化學鍵合的方法將酶固定到納米纖維復合膜上。但該方法由于酶固定的作用力較弱，使得在使用過程中酶分子容易從載體上脫落，影響固定化酶的重復利用性能。并且將酶吸附固定在納米纖維膜表面后，酶的微環境也發生了變化，使得酶與底物反應難度增加，也會導致固定化酶的酶活性降低。

中國專利文獻CN101845433A(申請號201010190239.1)公開了一種聚氨酯納米纖維固定化酶的制備方法，該方法以聚氨酯為原料，以一定配比的N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃為溶劑，或者以二甲基乙酰胺為溶劑，添加一定比例的LiCl制得電紡液，通過靜電紡絲制備出聚氨酯納米纖維。通過物理吸附的方法將惰性蛋白質吸附在纖維表面，獲得表面改性的聚氨酯納米纖維。然后利用戊二醛作為交聯劑，通過共價鍵結合的方法將酶固定化在表面改性的納米纖維上。該方法先制備納米纖維膜，然后通過戊二醛交聯法制備固定化酶，提高了酶固定化酶的穩定性。但是采用戊二醛交聯的方法固定化酶會破壞酶分子結構，使酶活發生一定程度降低；而且后固定酶的方法存在操作步驟繁瑣、經濟成本高等問題。

上述兩種方法大多只能將酶固定在纖維膜表面，使酶固定量受到限制，且反應過程中有酶脫落現象，導致酶重復利用性降低。另外，這些方法均采用先制備納米纖維膜、再加入酶的工藝路線。

環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)是一種重要的工業酶，它通過歧化和耦合反應將淀粉或環糊精分解成小分子糖，再將這些糖分子轉移到各種受體上，以得到理化性質更佳、附加值更高的受體分子衍生物。例如通過CGTase的歧化反應制備L-抗壞血酸(簡稱VC)的衍生物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)，在不影響VC生物活性的前提下顯著提高其穩定性，更利于工業生產、運輸和保存。它通過環化反應催化淀粉和線性低聚糖的轉糖基化反應，形成環狀結構的分子，稱為環糊精(CD)。

通常，工業生產中使用游離或可溶性CGTase。然而，工業應用中游離酶的主要缺點是價格相對較高，穩定性較差。國內外有很多的關于固定化環糊精葡萄糖基轉移酶材料的研究。在這些研究中，固定化酶在反應過程中由于固定化材料和酶的結合力不強，CGTase容易從固定材料上脫落，導致轉化反應后反應體系受到污染，并且固定化酶難以多次利用。例如：明膠和瓊脂糖固定化CGTase，固定酶機械強度較低，固定材料極易破裂并且受熱容易融化。海藻酸鈉固定化CGTase，雖然具有較好的機械強度，但是CGTase易從海藻酸鈉上脫落，酶活力損失嚴重，難以重復利用。

發明內容

本申請針對現有技術的不足提供了一種將酶固定到納米纖維上的方法。此方法可以用于對環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)進行固定化。

1.一種酶固定方法，其包括如下步驟：