[發明專利]基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法

在審

• 申請號: 202010791405.7
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111849888A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 劉煜凡;楊思明;付小兵;黃沙
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;宋丹丹

本發明提供了一種基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，該方法包括如下步驟：(1)將生物墨水、MSC懸浮液和小鼠足趾部真皮基質勻漿通過3D打印技術進行打印得到含MSC的3D打印基質；(2)將含有MSC的3D打印基質進行交聯；(3)將交聯后3D打印基質進行培養獲得汗腺細胞；其中，生物墨水的楊氏模量為160?380kPa，且孔隙率為0.5?0.7；本發明所提供的3D生物打印基質在不改變微觀結構的前提下改進了水凝膠生物墨水的硬度，該方法實現了對皮膚真皮基質硬度的模擬，實驗結果表明，該方法構建的3D生物打印基質能夠更高效的誘導MSC向功能性汗腺分化。

技術領域

本發明涉及干細胞分化技術領域，特別涉及基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法。

背景技術

覆蓋在機體表面的皮膚是機體最大的器官，其強大的防御能力能夠為機體抵御感染、損傷以及燒(創)傷等各種外界環境的侵害。維持機體的熱平衡是機體能夠正常運轉的重要環節，熱平衡的失調會導致一系列嚴重的并發癥，如中暑、高熱、熱驚厥、熱休克甚至是死亡。汗腺作為皮膚附屬器之一，其正常的發汗功能是機體維持熱平衡的最重要的途徑。由此可見，汗腺的存在以及功能的完整對于機體來說是不可或缺的。在臨床上，燒(創)傷引起的大面積真皮層皮膚缺失是導致汗腺缺失最主要的原因。因此，在燒(創)傷領域的研究中，針對含汗腺的皮膚再生的相關研究是該領域內不可回避的重要部分。

在既往研究中，針對汗腺細胞再生的研究多集中在二維結構，這不僅無法模擬細胞在機體中所處的三維立體環境，也無法有效地研究物理因素對干細胞分化的影響。僅有的少數關于三維環境下汗腺再生的研究，也因三維架構的硬度較低導致其研究成果難以實現臨床轉化。

現有關于汗腺修復的的研究較少，如申請號:CN201910895337.6的專利公開了一種誘導汗腺功能性修復的方法，該方法主要應用質粒轉染技術誘導表皮干細胞向汗腺細胞分化，并未考慮三維環境以及物理因素對干細胞的影響，且該方法中汗腺細胞的分別必須依賴表皮干細胞，應用范圍有限。

發明內容

為了解決以上技術問題，本發明提供了一種基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，該方法包括如下步驟：

(1)將生物墨水、MSC懸浮液和小鼠足趾部真皮基質勻漿通過3D打印技術進行打印得到含MSC的3D打印基質；

(2)將含有MSC的3D打印基質進行交聯；

(3)將交聯后3D打印基質進行培養獲得汗腺細胞；

其中，生物墨水的楊氏模量為160-380kPa，且孔隙率為0.5-0.7。

表皮干細胞與汗腺細胞為同譜系分化，難度較小。而間充質細胞向汗腺細胞分化為跨譜系分化，難度更大。在臨床轉化應用中，間充質干細胞的易獲取性以及汗腺的重要功能使得針對間充質干細胞向汗腺細胞分化的研究有著重要的意義，現有的關于生物墨水中的汗腺分化研究，所應用的水凝膠生物墨水強度低導致其可成型性較差，臨床轉化難度大，本發明針對該技術難題進行研究，發現當使用楊氏模量為160-380kPa，且孔隙率為0.5-0.7的生物墨水與SC懸浮液和小鼠足趾部真皮基質勻漿打印得到的3D打印基質再進行交聯、培養，得到的類汗腺細胞團更大，楊氏模量適中。

進一步地，步驟(1)的含MSC的3D打印基質的制備方法如下：取體積比為2:0.25-2:18的濃度為1.0×10⁷cell/ml的MSC懸浮液、小鼠足趾部真皮基質勻漿和生物墨水混合均勻后密封在無菌打印注射器中，將密封后的無菌打印注射器放置在4℃冷卻15-30min后，將無菌打印注射器安裝在生物打印平臺的打印臂上，設置溫度為15℃，同時將培養皿放在3D生物打印平臺，設置溫度為4℃，使用打印噴嘴構建含MSC的3D打印基質，即得載有MSC的3D打印基質。