[發明專利]基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法

在審

• 申請號: 202010791405.7
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111849888A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 劉煜凡;楊思明;付小兵;黃沙
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;宋丹丹

1.一種基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將生物墨水、MSC懸浮液和小鼠足趾部真皮基質勻漿通過3D打印技術進行打印得到含MSC的3D打印基質；

(2)將含有MSC的3D打印基質進行交聯；

(3)將交聯后3D打印基質進行培養獲得汗腺細胞；

其中，生物墨水的楊氏模量為160-380kPa，且孔隙率為0.5-0.7。

2.如權利要求1所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步驟(1)的含MSC的3D打印基質的制備方法如下：取體積比為2:0.25-2:18的濃度為1.0×10⁷cell/ml的MSC懸浮液、小鼠足趾部真皮基質勻漿和生物墨水混合均勻后密封在無菌打印注射器中，將密封后的無菌打印注射器放置在4℃冷卻15-30min后，將無菌打印注射器安裝在生物打印平臺的打印臂上，設置溫度為15℃，同時將培養皿放在3D生物打印平臺，設置溫度為4℃，使用打印噴嘴構建含MSC的3D打印基質，即得載有MSC的3D打印基質。

3.如權利要求1所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步驟(2)所述將含有MSC的3D打印基質進行交聯的具體方法為：將載有MSC的3D打印基質用濃度為2％-3％的氯化鈣溶液交聯8-12min，氯化鈣溶液浸沒3D打印基質。

4.如權利要求1所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步驟(3)進行培養獲得汗腺細胞具體包括以下步驟：先將交聯后的載有MSC的3D打印基質用DMEM培養基培養3天，3天后再用汗腺專用培養基培養，所述DMEM培養基和所述汗腺專用培養基均是每兩天更換一次；培養基培養的條件為放置于37℃，5％CO₂的無菌培養箱中培養。

5.如權利要求4所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述DMEM培養基是在DMEM培養基原液中加入5-15％(v/v)的胎牛血清FBS，0.8-1.2％(v/v)雙抗溶液，所述雙抗溶液為青霉素-鏈霉素混合液。

6.如權利要求4所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述汗腺專用培養基是將DMEM培養基原液和DMEM/F12培養基原液按1:1的比例混合，充分混勻后加入1-3ng/mL三碘甲狀腺原氨、4-6％(v/v)胎牛血清FBS、8-12ng/mLEGF、0.3-0.5μg/mL半琥珀酰氫化考的松、0.8-1.2％(v/v)雙抗溶液和0.8-1.2mL/100mLITS，所述雙抗溶液為青霉素-鏈霉素混合液。

7.如權利要求1所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述生物墨水通過以下方法制備而成：

稱取3.5-4.5重量份的海藻酸鈉和9-11重量份的明膠均勻混合，置入裝有90-110重量份的超純水中攪拌均勻制得海藻酸鈉-明膠混懸液；待海藻酸鈉-明膠混懸液中的海藻酸鈉和明膠完全溶解于超純水時，制得生物墨水。

8.如權利要求7所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述海藻酸鈉與所述明膠、超純水的質量比為4:10:100。

9.如權利要求7所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，將海藻酸鈉與明膠置入超純水中攪拌均勻后，還包括以下步驟：將海藻酸鈉-明膠混懸液于40-80℃條件下放置8-20小時，即可使海藻酸鈉-明膠混懸液中的海藻酸鈉和明膠完全溶解于超純水中。

10.如權利要求7所述的基于3D生物打印技術高效誘導間充質干細胞向汗腺分化的方法，其特征在于，海藻酸鈉-明膠混懸液中的海藻酸鈉和明膠完全溶解于超純水后還包括以下步驟：將打印基質通過巴氏消毒法滅菌，滅菌條件為：在60-80℃條件下滅菌10-60分鐘；再在1-8℃條件下滅菌3-10分鐘，循環交叉滅菌3次。