[發(fā)明專利]一種用于檢測HPV病毒和分型的微流控芯片

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010786653.2
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111876526A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何小鎮(zhèn);聶泳忠;許萬里;余桂榮;馬福軍
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué);西人馬大周(萍鄉(xiāng))醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12M1/34;C12M1/00;B01L3/00;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供了一種用于檢測HPV病毒和分型的微流控芯片，利用高特異性的MGB探針法，在HPV病毒基因E６E７區(qū)域設(shè)計各型別的特異引物和探針，將引物和探針及可以凍干成粉末的酶預(yù)混液包埋于微流控芯片內(nèi)，獲得的微流控芯片進(jìn)行檢測HPV病毒，操作簡單，成本較低，周期短，克服了目前基于通用引物HPV病毒檢測出現(xiàn)假陽性和假陽性，效率低，分型不準(zhǔn)確以及不全面的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測HPV病毒和分型的微流控芯片。

背景技術(shù)

人乳頭瘤病毒（Human Paillomavirus,HPV），屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的、環(huán)狀雙鏈DNA病毒，含有約7900 對堿基(bp)，共有3 個基因區(qū)組成，包括早期區(qū)(Early Region，E 區(qū))、晚期區(qū)(Late Region，L 區(qū)) 區(qū)和與非編碼區(qū)(UncodingRegion，UCR) 或上游調(diào)控區(qū)(URR)。E 區(qū)按順序為E6、E7、E1、E2、E3、E4 和E5 共7 個基因，參與病毒DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、編碼病毒蛋白、維持細(xì)胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)的基因，其中E6 和E7 是HPV 的主要致癌基因，與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關(guān)。HPV 通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，引起人類皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。

全球范圍的研究結(jié)果顯示，70%～80%的女性在其一生中會有至少一次的HPV 感染，在99.7%的宮頸癌患者體內(nèi)檢測到高危型HPV DNA 的存在，其中HPV16 型、18 型、45 型和31 型感染占80%。低危型HPV 一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤癌。因此HPV檢測對HPV病毒的檢測和分型顯得極為重要。關(guān)于高危型與低危型的劃分，國際上許多機(jī)構(gòu)都給出了參考建議，依據(jù)WHO 國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）及其他國際組織的研究成果，將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等13 種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82 等5 種基因型列為中等風(fēng)險型別。

在傳統(tǒng)的宮頸癌的診斷主要遵循“三階梯式”診斷程序，即宮頸細(xì)胞學(xué)、陰道鏡及組織病理學(xué)檢查。傳統(tǒng)的女性宮頸癌早期篩查主要是依靠這種“三階梯式”診斷程序，在用三種檢測方法時，在宮頸細(xì)胞取樣過程中容易使得病變細(xì)胞脫離，制片過程也極易使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化或者被其它炎癥細(xì)胞和血細(xì)胞覆蓋，同時結(jié)果判定太依靠于個人主觀判定，因此很容易發(fā)生疾病漏診。當(dāng)然現(xiàn)在也出現(xiàn)了一些現(xiàn)代分子檢測技術(shù)，如DNA雜交檢測技術(shù)、Q-PCR熒光染料檢測技術(shù)等，DNA雜交技術(shù)雖然檢測結(jié)果特異高，但是檢測成本和檢測過程復(fù)雜，極容易使得檢測過程出現(xiàn)差錯，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；Q-PCR熒光染料檢測技術(shù)雖然成本低，但是具有一個顯著的缺點，即其特異性非常容易受到非特異性基因擴(kuò)增和引物二聚體形成的影響，這使得雙鏈DNA 結(jié)合熒光染料qPCR 方法一直無法能夠有效地應(yīng)用于臨床檢測。然而MGB探針法qPCR 可以有效地解決雙鏈DNA 結(jié)合熒光染料qPCR 非特異性問題，MGB探針法qPCR具有特異性極強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點，可以在未來的臨床檢測和微流控芯片檢測中成為分子診斷的重要工具。

同時本發(fā)明是運用于微流控芯片的HPV病毒檢測和分型，微流控芯片操作簡便、價格低廉、樣品用量少、分析速度快且不依賴昂貴儀器，非常適合于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)對疾病的快速檢測和分析。該芯片可以擴(kuò)展到其它任意病原體的快速檢測，對于某些急性傳染性病原體的基層防控具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測HPV病毒和分型的微流控芯片，具體涉及一種基于微流控芯片的含高危和低危20種型別HPV病毒檢測和分型的方法。采用具有穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高等特點的MGB探針法，通過保守性高且不易發(fā)生丟失的E６、E７區(qū)域設(shè)計的型特異性引物，結(jié)合一種自主研發(fā)的可以凍干成粉末包埋于微流控芯片內(nèi)的Q-PCR引物和探針以及酶預(yù)混液，最終實現(xiàn)通過微流控芯片進(jìn)行檢測HPV病毒，操作簡單，成本較低，周期短。