[發明專利]創制番茄果實色澤材料的多基因編輯載體及方法

在審

• 申請號: 202010747466.3
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111979261A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 歐陽波;羅金英;姚紫蕾;賈罕澤布·加法爾;盧永恩;葉志彪;鄭偉;謝勇;李漢霞
• 申請（專利權）人: 武漢楚為生物科技股份有限公司;華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/08;A01H6/82
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 嚴超

1.一種創制番茄果實色澤材料的多基因編輯載體，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介導的多基因編輯體系可同時編輯番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一種創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，包括如下步驟：

構建可同時編輯番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因編輯載體，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示；

利用農桿菌介導番茄遺傳轉化，獲得番茄果實色澤材料。

3.根據權利要求2所述的創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，構建可同時編輯番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因編輯載體包括如下步驟：以pGTR質粒為模板，采用如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物序列進行PCR擴增，擴增反應后挖膠回收目的基因片段，經酶切后連接到pKSE401，轉化大腸桿菌感受態，選取大腸桿菌陽性克隆進行質粒抽提，導入農桿菌感受態細胞，獲得農桿菌陽性克隆。

4.根據權利要求3所述的創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，PCR擴增反應的程序依次為：95℃預變性3min；95℃變性15s，55℃復性15s，72℃延伸30s，循環38次；72℃延伸5min。

5.根據權利要求3所述的創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，鑒定陽性克隆所采用的引物序列分別如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

6.根據權利要求3所述的創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，鑒定番茄果實色澤材料編輯位點所采用的引物序列分別如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。

7.根據權利要求2至6任一項所述的創制番茄果實色澤材料的方法，其特征在于，所述番茄遺傳轉化采用的受體材料為MicroTOM番茄。