[發明專利]等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010745529.1
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111876512A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張仁利;張巖;陳木新;黃達娜;艾琳;陳燕旌;邊素瑩;唐屹君;鄭惠文;張倩;陳家旭;蘇川;周曉農
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心;微巖醫學科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 方良

本申請公開了一種等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑、試劑盒和檢測方法。所述試劑包括如下用于檢測杜氏利什曼原蟲的環介導等溫核酸擴增引物組：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一內引物SEQ ID No.3、第二內引物SEQ ID No.4、第一環引物SEQ ID No.5；用于檢測嬰兒利什曼原蟲的環介導等溫核酸擴增引物組：第三外引物SEQ ID No.6、第四外引物SEQ ID No.7、第三內引物SEQ ID No.8、第四內引物SEQ ID No.9、第二環引物SEQ ID No.10、第三環引物SEQ ID No.11。所述試劑盒包括所述試劑。所述試劑和試劑盒用于檢測兩種利什曼原蟲靈敏度高，重復性好、假陰性及假陽性低，檢測準確率高，還能夠實現通過裸眼觀察顏色變化而直接進行結果判斷。

技術領域

本申請屬于分子生物學檢測技術領域，尤其涉及一種等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑、試劑盒及其應用。

背景技術

利什曼病是由利什曼原蟲引起的一種疾病，它通過一些蛉的叮咬進行傳播。該疾病以三種主要方式出現：皮膚、粘膜皮膚或內臟。因此利什曼病又被分為皮膚利什曼病和內臟利什曼病(即黑熱病)。

黑熱病是最嚴重的利什曼病形式，如果不加以治療可能致命。在感染后數月至數年內還可能發生發燒、脾臟和肝臟受損以及貧血，也有可能會出現“黑熱病后皮膚利什曼病”。該疾病是世界上第二大寄生蟲殺手(僅次于瘧疾)，估計每年導致全世界2萬到3萬例的死亡。

目前全世界上已知的有兩種利什曼原蟲引起內臟疾病。在東非和印度常見的種類是杜氏利什曼原蟲，在歐洲、北非和拉丁美洲常見的嬰兒利什曼原蟲。

診斷的金標準是可視化脾臟抽吸物或骨髓抽吸物中的寄生蟲。這是一個技術難題，在世界上內臟利什曼病流行的地區通常不可用。血清學檢測存在許多問題，在高度流行的地區，并非每個被感染的人都會實際患上臨床疾病或需要治療。實際上，多達32％的健康人群可能會呈陽性反應，但不需要治療。相反，由于血清學檢測只針對免疫反應而不是生物體本身，因此在患者治愈后該檢測不會變為陰性，因此不能用作治愈檢查或再感染或復發的檢查。同樣，免疫系統異常(例如HIV感染)的患者將接受假陰性檢測。

多種不同的聚合酶鏈反應(PCR)測試可用于檢測利什曼原蟲DNA。借助該測定，最終可能實現特異性且靈敏的診斷程序。使用這種特定方法，即使寄生蟲的量非常低，仍然可以檢測利什曼原蟲。當需要診斷特定的利什曼原蟲物種時，與檢測有無相比，分子生物學方法更為出色。但目前PCR是熒光染料，其檢測的通病就是需要專業人員操作和專業昂貴儀器。

另外，現有待測樣品核酸的需要移液器、槍頭、離心機、恒溫金屬浴和PCR儀等昂貴且不便于攜帶的儀器，且提取需要專業人士進行專業操作，這直接導致現有樣本核酸提取和PCR檢測不方便，且需要專業人員操作，且成本高。

發明內容

本申請的目的在于提供一種檢測等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑、試劑盒以及其應用，旨在解決現有技術熒光PCR檢測方法操作需要專業操作，而且成本高，檢測不方便的技術問題。

為了實現本發明的發明目的，本發明的一方面，提供了一種等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑。所述等溫擴增檢測兩種利什曼原蟲的試劑包括如下用于檢測杜氏利什曼原蟲環介導等溫核酸擴增引物組：

第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一內引物SEQ ID No.3、第二內引物SEQ ID No.4、第一環引物SEQ ID No.5；

用于檢測嬰兒利什曼原蟲的環介導等溫核酸擴增引物組：

第三外引物SEQ ID No.6、第四外引物SEQ ID No.7、第三內引物SEQ ID No.8、第四內引物SEQ ID No.9、第二環引物SEQ ID No.10、第三環引物SEQ ID No.11。