[發明專利]β-酮己二酸代謝相關三個基因的結構優化與應用

有效

• 申請號: 202010742556.3
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111662892B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 王波;姚泉洪;彭日荷;田永生;高建杰;許晶;付曉燕;韓紅娟;李振軍;王麗娟;張福建;鄧永東;張文慧;黃悠楠
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C02F3/34
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本發明公開了一種優化后適用于大腸桿菌表達的β?酮己二酸代謝相關的三個基因及其應用。每個基因都由獨立的T7啟動子和終止子控制，其核苷酸序列分別如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，其編碼的蛋白質的氨基酸序列分別如SEQ ID No 4、SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示。本發明優化合成的基因能夠在大腸桿菌中成功表達，工程菌能夠將β?酮己二酸完全降解且以β?酮己二酸為碳源生長，優化后基因可用于構建有機污染修復工程生物。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及結構優化的β-酮己二酸利用相關三個基因的序列。

技術背景

芳香族化合物是一類重要的有機污染物，它能通過各種工業、農業、制藥和市政排放等人類活動進入環境造成污染。而傳統的污染修復方式主要是物理和化學方法，存在成本高、設施復雜、修復效率低等問題。通過生物處理，修復環境中的芳香族污染物是一個可行的替代方案。對降解機理的深入研究，有助于我們充分利用豐富的自然資源。

目前已發現許多好氧細菌和真菌能夠以某種芳香族化合物為唯一碳源和能源，這證明在這些微生物中存在這些芳香族化合物的代謝途徑。目前，普遍認為微生物可以在有氧或者厭氧條件下對芳香族化合物降解先是通過外圍代謝途徑（Peripheral catabolicpathway）將不同的酚類化合物轉化為少數幾種核心代謝產物（Predominant products）包括：鄰苯二酚、對苯二酚及它們的衍生物等，而這些核心代謝產物再通過一些相同或相似的核心代謝途徑（Central catabolic pathway）轉化為三羧酸循環的中間代謝物（Citratecycle itermediates），最終為微生物所利用。

β-酮己二酸途徑就是一個廣泛存在于土壤細菌和真菌中核心代謝途徑。核心代謝產物原兒茶酸或鄰苯二酚通過不同的分支形成β-酮己二酸內酯，之后通過共同途徑生成β-酮己二酸。而β-酮己二酸再通過β-酮己二酸琥珀酰輔酶A轉移酶和β-酮己二酸單酰輔酶A硫解酶的催化生成琥珀酰輔酶A和乙酰輔酶A，從而進入三羧酸循環，為微生物所利用。這一代謝途徑是許多芳香族化合物降解的最終通路，也是將降解產物與三羧酸循環鏈接的橋梁，主要包括苯、酚、甲苯、苯甲酸、烷基苯、硝基酚、氯酚、萘等都能通過β-酮己二酸途徑降解。

雖然目前已知大量微生物具有有機污染物降解能力，但具體到能降解某一特定種類物質時，可供選擇的微生物數量和種類比較有限，難以滿足生物修復技術的需求。通過生物技術手段，選擇合適的宿主，構建污染修復工程生物是一種可行的解決方案。而β-酮己二酸到琥珀酰輔酶A和乙酰輔酶A轉化，是β-酮己二酸途徑是不同代謝分支匯合后的最終代謝過程，是將有機污染物中的碳原子引入微生物自身代謝網絡并供其利用的橋梁，是構建多種不同有機污染修復工程生物的基礎，因此成功實現這一代謝途徑的異源表達具有重要的意義及應用潛力。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供能夠在大腸桿菌中表達的β-酮己二酸代謝相關三個基因的優化重組與應用：

pcaI基因：編碼β-酮己二酸琥珀酰輔酶A轉移酶α亞基

pcaJ基因：編碼β-酮己二酸琥珀酰輔酶A轉移酶β亞基

pcaF基因：編碼β-酮己二酸單酰輔酶A硫解酶

β-酮己二酸經過兩步酶促反應生成珀酰輔酶A和乙酰輔酶A。