[發明專利]一種γ-谷氨酰甲胺合成酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202010736674.3
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111808829B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 范文超;王金剛;梁巖;高書良
• 申請（專利權）人: 浙江華睿生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種γ?谷氨酰甲胺合成酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:5，與野生型γ?谷氨酰甲胺合成酶相比，提高了催化谷氨酸鈉和乙胺反應生產茶氨酸的酶活力，最高可以生成63.01g/L的L?茶氨酸，產物生成率超過90％，產物ee值超過99％，具有較好的工業化開發應用前景。

技術領域

本發明屬于酶催化技術領域，具體地說，涉及一種γ-谷氨酰甲胺合成酶突變體、及其用于酶法催化谷氨酰胺與乙胺發生縮合反應生成L-茶氨酸的用途。

背景技術

茶氨酸(Theanine)是1950年日本學者酒戶彌二郎首次從綠茶中分離出來的，在自然界它僅存在于茶植物中，占茶葉干重的1％～2％，它以一種游離的形式存在而且是茶葉中主要的氨基酸，占所有游離氨基酸的50％左右。

茶氨酸為人體所必需，但人體內不能合成，要靠外界供給。自然界中存在的茶氨酸均為L型，化學名為N-乙基-γ-谷氨酰胺，純品為白色針狀晶體，熔點217-218℃，比旋光[α]D＝+7.7-8.5，分子量為174.2。茶氨酸極易溶于水，不溶于乙醇和乙醚，有茚三酮反應，加熱后可生成紫色物質，跟堿式碳酸酮反應后可生成淺紫色柱狀銅鹽，可被25％硫酸或6M鹽酸水解成L-谷氨酸和乙胺。

目前茶氨酸的制備方法主要有三種：植物提取法、化學合成法、酶催化合成法。植物提取法主要以茶葉為原料采用堿式碳酸酮沉淀法或離子交換分離提取法兩種方法進行提取，其中離子交換分離提取法收率可達88％，但受限于原料問題，產能不足，純品提取成本大；化學合成法中，國內湘潭大學2017年采用采用N-取代谷氨酸甲酯法，利用催化效率高的三乙胺和氨基保護劑乙酰丙酮，獲得了底物轉化率82％的生產工藝，是查到的化學合成工藝中轉化率最高的，但產物手性純度低、過程涉及多種有機溶劑，生產過程涉及易燃易爆，且原料成本等問題，使得化學法合成工藝也沒有規模產業化；酶催化合成L-茶氨酸因為其廉價的底物、安全的催化過程、高手性純度產物等方面的優點，成為非常有潛力的一種L-茶氨酸的合成方法，目前有四種類型的酶可以參與催化合成L-茶氨酸，包括谷氨酰胺合成酶(GS)、γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)和γ-谷氨酰胺酶。但該方法現在存在的問題，要么體系中涉及ATP再生，生產成本上升(如GS和 GMAS)，要么催化體系底物轉化效率低，乙胺鹽大量殘留。2008年，Yamamoto S等采用 Methylovorus mays NO.9來源的大腸桿菌重組GMAS，催化等摩爾的谷氨酸鈉和鹽酸乙胺，最終獲得110g/L L-茶氨酸，這是查閱到產量最高的文獻報道，但一方面，因該酶的比活較低，該催化體系只能采用純酶才能實現，另一方面，該催化體系采用了酵母菌作為ATP的再生工具，這兩個方面的成本增加，導致該體系很難被產業化。專利文獻CN201510973289.X 報道了采用來源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶和一種磷酸激酶為催化劑，以 L-谷氨酸鈉和乙胺鹽酸鹽為底物合成L-茶氨酸。

據該專利文獻報道，其L-茶氨酸的轉化率可高達80％以上，ee值達到99％以上。但我們在研究該技術時，發現重現性低，該反應中酶活力偏低，存在明顯的產物抑制現象，難以實現產物的有效積累，因而不具有工業化前景。

發明內容

為了解決現有γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)催化制備L-茶氨酸，酶比活低、容易導致產物抑制性的工業化掣肘問題，本發明對多種微生物來源的酶GS、GMAS、GGT進行了廣泛篩選。并且重點對Methyloversatilis universalis和Methylovorus mays NO.9兩種微生物來源的GMAS野生酶(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)進行了研究，利用基因工程技術進行改造和鑒定，確定出一種酶比活相對較高的基因進行定向進化，篩選酶活力高、底物抑制性和產物抑制性低的γ-谷氨酰甲胺合成酶突變體，提高了單位酶活的催化效率。具體而言，本發明包括如下技術方案：