[發明專利]測定9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的特異性肽段及方法

在審

• 申請號: 202010732651.5
• 申請日: 2020-07-27
• 公開（公告）號: CN113984947A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 王佑春;龍珍;黃維金;李長坤;李曉玉;聶建輝;李月琪;黃濤宏
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院;島津企業管理（中國）有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 濟南克雷姆專利代理事務所(普通合伙) 37279
• 代理人: 楊婷

本發明公開了測定9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的特異性肽段，包括測定HPV?6、HPV?11、HPV?16、HPV?18、HPV?31、HPV?33、HPV?45、HPV?52和HPV?58的9種肽段。本發明還公開了一種9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的測定方法：對待測樣品進行胰蛋白酶酶解，得酶解液，對酶解液進行高效液相色譜串聯質譜分析，得色譜圖，計算9種特異性肽段的響應峰面積，代入標準工作曲線，計算得出待測樣品各抗原蛋白的含量。本發明通過酶解條件優化、質譜條件優化、穩定性、靈敏度、線性、重復性和回收率測試，篩選出9種抗原蛋白適合的定量肽段。本發明可用于不同廠家、不同批次9價HPV疫苗中9種抗原蛋白的含量測定，對改進疫苗研發、生產和質量評價具有借鑒意義。

技術領域

本發明涉及測定9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的特異性肽段及方法，具體涉及測定9價HPV疫苗中抗原蛋白HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-52和HPV-58含量的肽段和方法，屬于疫苗質量評價技術領域。

背景技術

人乳頭瘤病毒是引起女性宮頸癌病的主要因素，是世界范圍內第四大導致女性癌癥死亡的因素。人乳頭瘤病毒疫苗(即HPV疫苗)的出現為預防人乳頭瘤病毒感染引起的宮頸病變發揮了極大作用。據臨床數據顯示，2價HPV疫苗(HPV-16/18)可預防70％宮頸早期癌變感染，9價HPV疫苗(HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58)可預防95％以上宮頸早期癌變感染。疫苗中抗原蛋白的含量與疫苗的有效性和安全性直接相關：若抗原蛋白含量過低，會導致疫苗免疫原性較差，無法達到刺激免疫系統產生抗體的目的，因此有效性較差；若抗原蛋白過高，則可能導致一定的毒副作用，影響疫苗的安全性。因此，HPV疫苗中抗原蛋白的含量測定是HPV疫苗質量控制的關鍵參數之一。

由于不同型別HPV抗原蛋白對疾病的預防存在差異，需嚴格控制HPV疫苗中不同型別抗原蛋白的含量和比例，從而保障HPV疫苗的安全性和有效性。有文獻報道用ELISA方法測定HPV抗原蛋白，但該方法受樣品基質組成、測試條件、抗體質量的影響較大，從而導致方法重復性較差。此外，該方法難以解讀影響疫苗質量差異的原因，從而無法為疫苗生產提供指導和改進建議。Lowry法也可用于抗原蛋白的含量測定，但該方法只能檢測總蛋白含量，無法實現復雜基質中不同抗原蛋白含量檢測。本發明的發明人所在實驗室在前期的研究中開法了一種基于合成肽段的2價HPV疫苗抗原蛋白含量測定方法，該方法可在一定程度上實現HPV-16/18的抗原蛋白含量測定，但該方法需要購買合成肽段，成本較高，且測試準確性受酶解效率和合成肽段穩定性的影響。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了測定9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的特異性肽段，以及具體的測定方法。本發明篩選到了適合作為抗原蛋白定量測定的特異性肽段，采用高效液相色譜串聯質譜方法，建立了一種高通量、高選擇性、高靈敏度的9價HPV疫苗有效成分HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58的定量方法，用于9價HPV疫苗中HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58的定量分析。該方法可用于9價HPV疫苗定量對照品篩查，同一廠家不同批次疫苗成品穩定性評價，不同廠家疫苗成品對比，疫苗上清液中游離抗原蛋白檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：

測定9價HPV疫苗中抗原蛋白含量的特異性肽段，包括測定HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-52和HPV-58(HPV疫苗中所含的9種抗原蛋白)的9種肽段，具體如下：

測定HPV6的肽段：選自SDVPIDICGTTCK，AGEVGEPVPDTLIIK，FSSELDQYPLGR中的至少一條；

測定HPV11的肽段：選自GQPLGVGVSGHPLLNK，LFFYLR，AGTVGEPVPDDLLVK，FSSELDQFPLGR中的至少一條；